新型鵝細小病毒(NGPV)核酸檢測試劑盒(熒光 PCR 法)
【產品名稱】
商品名稱:新型鵝細小病毒(NGPV)核酸檢測試劑盒(熒光 PCR 法)
Name:Diagnostic Kit for Novel goose parvovirus DNA(Real-Time PCR Method)
【包裝規格】25T/盒、50T/盒
【預期用途】
新型鵝細小病毒(Novel goose parvovirus, NGPV)屬細小病毒科(Parvoviridae)、細小病毒亞科(Parvovirinae)、依賴病毒屬(Dependovirus)。新型鵝細小病毒病是由新型鵝細小病毒(novel goos e parvovirus,NGPV)引起的一種病毒性傳染病,又稱短喙侏儒綜合征(short beak and dwarfism syndrome,SBDS),主要感染櫻桃谷北京鴨、番鴨、半番鴨等。臨床表現為短喙、舌頭外伸、腿骨易折斷、生長發育受阻、死亡等典型的 SBDS 癥狀, 發病率高但死亡率低。
本試劑盒適用于檢測水禽類心臟、肝臟、脾臟等組織樣本及糞便樣本中的新型鵝細小病毒,用于新型鵝細小病毒感染的輔助診斷,其檢測結果僅供參考。
【檢驗原理】
本試劑盒采用 TaqMan 探針法實時熒光 PCR 技術,設計一對新型鵝細小病毒病毒特異性引物,結合一條特異性探針,用熒光 PCR 技術對新型鵝細小病毒的核酸進行體外擴增檢測,用于臨床上對可疑感染病料的病原學診斷。
【試劑組成】
包裝規格25T/盒50T/盒
NGPV 反應液500μL×1 管500μL×2 管
酶液25μL×1 管50μL×1 管
NGPV 陽性質控品50μL ×1 管50μL ×1 管
陰性質控品250μL ×1 管250μL ×1 管
說明:不同批號的試劑盒組分不可交互使用。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃,避光保存、運輸、反復凍融次數不超過 5 次,有效期 12 個月。
【適用儀器】
ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。
【標本采集】
對于死亡水禽,可直接采集心臟、肝臟、脾臟等組織,于 0℃ ~4℃冷藏保存并立即送檢,采樣過程中樣品不得交叉污染[1]。
對于活水禽,可直接采集糞便。
【保存和運輸】
采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應不超過 24 h;若需長期保存,應放置-70℃以下保存,凍融不超過 3 次。
【使用方法】
1.樣品處理(樣本處理區)
1.1樣本前處理
死亡水禽,剖檢取心臟、肝臟、脾臟等組織,可單獨使用,也可混合使用。各組織剪碎后研磨成糊狀,按
1:5 加入生理鹽水,將混懸液收集于離心管內,-20℃反復凍融三次,以 6000g 離心 5min,取上清液待檢[1]
活禽,取糞便于 1×PBS 中,混勻后瞬時離心,取上清。
1.2核酸提取
推薦采用優利科(上海)生命科學有限公司生產的核酸提取或純化試劑(磁珠法或離心柱法)進行核酸提取, 請按照試劑說明書進行操作。
2.試劑配制(試劑準備區)
根據待檢測樣本總數,設所需要的 PCR 反應管管數為 N(N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照;樣品每滿
10 份,多配制 1 份),每測試反應體系配制如下表:
試劑NGPV 反應液酶液
用量(樣本數為 N)19μL1μL
將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中,20μL/管。
3.加樣(樣本處理區)
將步驟 1 提取的核酸、陽性質控品、陰性質控品各取 5μL,分別加入相應的反應管中,蓋好管蓋,混勻, 短暫離心。
4.PCR 擴增(核酸擴增區)
4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內;
4.2設置好通道、樣品信息,反應體系設置為 25μL;
熒光通道選擇: 檢測通道(Reporter Dye)FAM, 淬滅通道(Quencher Dye)NONE,請勿選擇 ROX 參比熒光。
4.3推薦循環參數設置:
步驟循環數溫度時間收集熒光信號
11 cycle95℃2min否
245 cycles95℃15sec否
60℃30sec是
5.結果分析判定
5.1結果分析條件設定(請參照各儀器使用說明書進行設置,以分析 ABI7500 儀器為例)
反應結束后自動保存結果,根據分析后圖像調節 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值(用戶可根據實際情況自行調整,Start 值可設在 3~15、End 值可設在 5~20,使閾值線位于擴增曲線指數期,陰性質控品的擴增曲線平直或低于閾值線),點擊 Analyze 自動獲得分析結果。
5.2結果判斷
陽性:檢測通道 Ct 值≤40,且曲線有明顯的指數增長曲線; 陰性:樣本檢測結果 Ct 值>40 或無 Ct 值。
5.3質控標準
陰性質控品:無特異性擴增曲線或無 Ct 值顯示;
陽性質控品:擴增曲線有明顯指數增長期,且 Ct 值≤32; 以上條件應同時滿足,否則實驗視為無效。
6.檢測方法的局限性
1.樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關;
2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會出現假陽性結果;
3.陽性對照、擴增產物泄漏,會導致假陽性結果;
4.病原體在流行過程中基因突變、重組,會導致假陰性結果;
5.不同的提取方法存在提取效率差異,會導致假陰性結果;
6.試劑運輸,保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降,出現假陰性或定量檢測不準確的結果;
7.本檢測結果僅供參考,如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。
【注意事項】
1.所有操作嚴格按照說明書進行;
2.試劑盒內各種組分使用前應自然融化,完-全混勻并短暫離心;
3.反應液應避光保存;
4.反應中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;
5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區專用工作服;
6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行,以免交叉污染;
7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器;
8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待,并按照《微生物生物醫學實驗室生物安全通則》進行處理。
【參考文獻】
[1]江蘇省質量技術監督局,DB32/T 1460-2009,鵝細小病毒的檢測 PCR 方法[S]
[2]遼寧科學技術出版社,《禽病學》第 14 版(譯),ISBN 978-7-5591-2094-6,中國版本圖書館 CIP 數據核字
(2023)第 110085 號
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