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新城疫病毒(NDV)核酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

閱讀:124      發(fā)布時(shí)間:2024-11-01
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【產(chǎn)品名稱(chēng)】

商品名稱(chēng):新城疫病毒(NDV)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光 PCR 法) 

Name:Newcast Disease virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】25T/盒、50T/盒

【預(yù)期用途】

新城疫是由新城疫病毒(New castle disease viurs, NDV)引起的一種禽類(lèi)急性、高度接觸性傳染病。ND 常呈敗血癥經(jīng)過(guò),以呼吸困難、神經(jīng)機(jī)能紊亂、粘模和漿膜出血等為主要特征。由于該病發(fā)病急、致死率高,對(duì)養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展構(gòu)成嚴(yán)重威脅,世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將新城疫,列為法定報(bào)告的動(dòng)物疫病,我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部將其列為一類(lèi)動(dòng)物疫病。

本試劑盒適用于檢測(cè)的禽類(lèi)動(dòng)物腦、肺、脾、腎、腸(包括內(nèi)容物)、氣管、肝、心等組織、口咽和泄殖腔拭   子等標(biāo)本中新城疫病毒 RNA,適用于新城疫病毒感染的輔助診斷。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒用一對(duì)新城疫病毒特異性引物,結(jié)合一條特異性熒光探針,用一步法熒光 RT-PCR 技術(shù)對(duì)新城疫病毒 RNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè),用于臨床上對(duì)可疑感染病料的病原學(xué)診斷。

【試劑組成】

包裝規(guī)格25T/盒50T/盒

NDV 反應(yīng)液500μL×1 管500μL×2 管

酶液25μL×1 管50μL×1 管

NDV 陽(yáng)性質(zhì)控品50μL ×1 管50μL ×1 管

陰性質(zhì)控品250μL ×1 管250μL ×1 管

說(shuō)明:不同批號(hào)的試劑盒組分不可交互使用

【儲(chǔ)存條件及有效期】

-20℃±5℃,避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過(guò) 5 次,有效期 12 個(gè)月。

【適用儀器】

ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測(cè)儀。

【標(biāo)本采集】

病死或撲殺禽,取腦、肺、脾、腎、腸(包括內(nèi)容物)、氣管、肝、心等組織臟器;待檢活禽,用拭子采集口咽和泄殖腔拭子,放入盛有 2.0 mL 的 PBS(0.01 mol/L、pH 7.0~7.4,含青霉素 2 000 U/mL、鏈霉素 2 mg/mL、10%甘油)的采樣管。

【保存和運(yùn)輸】

采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過(guò) 24 h;若需長(zhǎng)期保存,應(yīng)放置-70℃以下保存,凍融不超過(guò) 3 次。

【使用方法】

1.樣品處理(樣本處理區(qū))

1.1樣本前處理

每份組織用無(wú)菌的剪刀和攝子剪取待檢樣品,置組織勻漿器充分研磨,置于含抗生素的 PBS(0.01 moL/L、pH 7.0~7.4)中,制成濃度為 10%~20%的懸浮液,凍融 2 次~3 次,室溫(20 ℃~25℃)靜置 1 h~2 h,3000 r/min 離心5 min,取上清液轉(zhuǎn)入無(wú)菌的 1.5 mL 離心管中;拭子樣品在振蕩器上充分混合后,將拭子中的液體充分?jǐn)D壓后棄去拭子,室溫靜置作用 30 min,3000 r/min 離心 5 min,取上清液轉(zhuǎn)入無(wú)菌的 1.5 mL 離心管中。

1.2核酸提取

推薦采用優(yōu)利科(上海)生命科學(xué)有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑(磁珠法或離心柱法)進(jìn)行核酸提取, 請(qǐng)按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2.試劑配制(試劑準(zhǔn)備區(qū))

根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù),設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽(yáng)性對(duì)照;反應(yīng)管數(shù)每滿 10 份,多配制 1 份),每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表:

試劑NDV 反應(yīng)液酶液

用量19μL1μL

將混合好的測(cè)試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中,20μL/管。

3.加樣(樣本處理區(qū))

將步驟 1 提取的核酸、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 5μL,分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中,蓋好管蓋,混勻, 短暫離心。

4.PCR 擴(kuò)增(核酸擴(kuò)增區(qū))

4.1將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi);

4.2設(shè)置好通道、樣品信息,反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL;熒光通道選擇: 檢測(cè)通道(Reporter Dye)FAM, 淬滅通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列儀器請(qǐng)勿選擇 ROX 參比熒光,選擇 None 即可。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置:

步驟循環(huán)數(shù)溫度時(shí)間收集熒光信號(hào)

11 cycle50℃10min

21 cycle95℃2min

345 cycles95℃15sec

60℃30sec

5.結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定(請(qǐng)參照各儀器使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行設(shè)置,以分析 ABI7500 儀器為例)

反應(yīng)結(jié)束后自動(dòng)保存結(jié)果,根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值(用戶可根據(jù)實(shí)際情況自行調(diào)整,Start 值可設(shè)在 3~15、End 值可設(shè)在 5~20,使閾值線位于擴(kuò)增曲線指數(shù)期,陰性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線平直或低于閾值線),點(diǎn)擊 Analyze 自動(dòng)獲得分析結(jié)果。

5.2結(jié)果判斷

陽(yáng)性:檢測(cè)通道 Ct 值≤40,且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線; 陰性:樣本檢測(cè)結(jié)果 Ct 值>40 或無(wú) Ct 值。

5.3質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品:無(wú)特異性擴(kuò)增曲線或無(wú) Ct 值顯示;

陽(yáng)性質(zhì)控品:擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期,且 Ct 值≤32; 以上條件應(yīng)同時(shí)滿足,否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。

6.檢測(cè)方法的局限性

1.樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān);

2.樣本提取過(guò)程中沒(méi)有控制好交叉污染,會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果;

3.陽(yáng)性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏,會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果;

4.病原體在流行過(guò)程中基因突變、重組,會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果;

5.不同的提取方法存在提取效率差異,會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果;

6.試劑運(yùn)輸,保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降,出現(xiàn)假陰性或定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果;

7.本檢測(cè)結(jié)果僅供參考,如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測(cè)手段。

【注意事項(xiàng)】

1.所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行;

2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,完-全混勻并短暫離心;

3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存;

4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專(zhuān)用工作服;

6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行,以免交叉污染;

7.實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器;

8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待,并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。

【參考文獻(xiàn)】

[1]國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. GB/T 16550-2020 新城疫診斷技術(shù)[S].

[2]國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. SN/T 0764-2011 新城疫檢疫技術(shù)規(guī)范[S].

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