【產品名稱】
商品名稱：禽肺病毒（APV）核酸檢測試劑盒(熒光 PCR 法)
Name：Avian Pneumovirus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規格】25T/盒、50T/盒
【預期用途】
禽肺病毒（Avian Pneumovirus, APV）是火雞鼻氣管炎（TRT）和雞肺病毒感染的病原。禽類受感染后可引起呼吸道癥狀、頭部腫脹和產蛋率下降等癥狀[1,2]。
本試劑盒適用于檢測的肺組織、呼吸道分泌物、全血等標本中禽肺病毒核酸，適用于禽肺病毒感染的輔助診斷。
【檢驗原理】
本試劑盒根據禽肺病毒基因保守區設計特異性引物和熒光探針，用一步法熒光 RT-PCR 技術對禽肺病毒核酸進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。
【試劑組成】
包裝規格25T/盒50T/盒
APV 反應液500μL×1 管500μL×2 管
酶液25μL×1 管50μL×1 管
APV 陽性質控品50μL ×1 管50μL ×1 管
陰性質控品250μL ×1 管250μL ×1 管
說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數不超過 5 次，有效期 12 個月。
【適用儀器】
ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。
【標本采集】
病死或撲殺禽，取肺組織；待檢活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物，放于 1mL 50%甘油生理鹽水中；用注射器取血 5mL。
【保存和運輸】
采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應不超過 24 h；若需長期保存，應放置-70℃以下保存，凍融不超過 3 次。
【使用方法】
1.樣品處理（樣本處理區）
1.1樣本前處理
組織樣品：稱取約 1g，手術剪剪碎混勻后于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續研磨，待勻漿后轉至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；棉拭子直接取 100μL 于1.5mL 滅菌離心管中。全血樣本待血凝后取 100μL 血清于 1.5mL 滅菌離心管中。
1.2核酸提取
推薦采用優利科（上海）生命科學有限公司生產的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進行核酸提取， 請按照試劑說明書進行操作。
2.試劑配制（試劑準備區）
根據待檢測樣本總數，設所需要的 PCR 反應管管數為 N(N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照；反應管數每滿 10 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：
試劑APV 反應液酶液
用量19μL1μL
將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，20μL/管。
3.加樣（樣本處理區）
將步驟 1 提取的核酸、陽性質控品、陰性質控品各取 5μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻， 短暫離心。
4.PCR 擴增（核酸擴增區）
4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內；
4.2設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；
熒光通道選擇：檢測通道（ReporterDye）FAM，淬滅通道（QuencherDye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX
參比熒光，選擇 None 即可。
4.3推薦循環參數設置：
步驟循環數溫度時間收集熒光信號
11 cycle50℃10min否
21 cycle95℃2min否
345 cycles95℃15sec否
60℃30sec是
5.結果分析判定
5.1結果分析條件設定（請參照各儀器使用說明書進行設置，以分析 ABI7500 儀器為例）
反應結束后自動保存結果，根據分析后圖像調節 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據實際情況自行調整，Start 值可設在 3～15、End 值可設在 5～20，使閾值線位于擴增曲線指數期，陰性質控品的擴增曲線平直或低于閾值線），點擊 Analyze 自動獲得分析結果。
5.2結果判斷
陽性：檢測通道 Ct 值≤40，且曲線有明顯的指數增長曲線； 陰性：樣本檢測結果 Ct 值>40 或無 Ct 值。
5.3質控標準
陰性質控品：無特異性擴增曲線或無 Ct 值顯示；
陽性質控品：擴增曲線有明顯指數增長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。
6.檢測方法的局限性
1.樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關；
2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現假陽性結果；
3.陽性對照、擴增產物泄漏，會導致假陽性結果；
4.病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；
5.不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；
6.試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現假陰性或定量檢測不準確的結果；
7.本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。
【注意事項】
1.所有操作嚴格按照說明書進行；
2.試劑盒內各種組分使用前應自然融化，wan全混勻并短暫離心；
3.反應液應避光保存；
4.反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區專用工作服；
6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行，以免交叉污染；
7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；
8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫學實驗室生物安全通則》進行處理。
【參考文獻】
[1]孫石開,劉闖,魯俊鵬,等.禽肺病毒研究進展[J].中國預防獸醫學報,2012.
[2]謝志勤,謝芝勛,范晴,等.H9 亞型禽-流-感病毒和禽肺病毒二重 RT-PCR 檢測方法的建立[J].動物醫學進展,2016.
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