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優利科(上海)生命科學有...

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鴿瘟(PPMV-1)核酸檢測試劑盒說明書

閱讀:127      發布時間:2024-11-09
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商品名稱:鴿瘟(PPMV-1)核酸檢測試劑盒(熒光 PCR 法))

Name:Pigeon Paramyxovirus type 1 Detection Kit(Real-Time PCR Method)

【包裝規格】25T/盒、50T/盒

【預期用途】

鴿瘟是由鴿 1 型副黏病毒( Pigeon paramyxovirus type 1, PPMV-1)引起的一種高度接觸性傳染病,引起的臨床癥狀與雞新城疫非常相似,主要表現為扭頭歪脖、癱瘓等神經癥狀和腹瀉、排綠色稀糞等消化道癥狀。

本試劑盒適用于檢測腦、肺、牌、腎、腸(包括內容物)、氣管、肝、心等組織、口咽和泄殖腔拭子等標本中   鴿 1 型副黏病毒 RNA,適用于鴿 1 型副黏病毒感染的輔助診斷。

【檢驗原理】

本試劑盒采用 TaqMan 探針法實時熒光 PCR 技術,設計一對鴿 1 型副黏病毒特異性引物,結合一條特異性探針,用熒光 PCR 技術對鴿 1 型副黏病毒的 RNA 進行體外擴增檢測,用于臨床上對可疑感染病料的病原學診斷。

【試劑組成】

包裝規格25T/盒50T/盒

PPMV-1 反應液500μL×1 管500μL×2 管

酶液25μL×1 管50μL×1 管

PPMV-1 陽性質控品50μL ×1 管50μL ×1 管

陰性質控品250μL ×1 管250μL ×1 管

說明:不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃,避光保存、運輸、反復凍融不超過 5 次,有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】

病死或撲殺鴿子,取腦、肺、脾、腎、腸(包括內容物)、氣管、肝、心等組織臟器;待檢活鴿子,用拭子采集口咽和泄殖腔拭子,放入盛有 2.0mL 的 PBS(0.01mol/L、pH7.0~7.4,含青霉素 2000U/mL、鏈霉素 2mg/mL、10%甘油)的采樣管。

【保存和運輸】

采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應不超過 24 h;若需長期保存,應放置-70℃以下保存,凍融不超過 3 次。

【使用方法】

1.樣品處理(樣本處理區)

1.1樣品前處理

每份組織用無菌的剪刀和攝子剪取待檢樣品,置組織勻漿器充分研磨,置于含抗生素的 PBS(0.01moL/L、pH7.0~7.4)中,制成濃度為 10%~20%的懸浮液,凍融 2 次~3 次,室溫(20℃~25℃)靜置 1h~2h,3000r/min 離心 5min,取上清液轉入無菌的 1.5mL 離心管中;拭子樣品在振蕩器上充分混合后,將拭子中的液體充分擠壓后棄去拭子, 室溫靜置作用 30min,3000r/min 離心 5min,取上清液轉入無菌的 1.5mL 離心管中。

1.2核酸提取

推薦采用優利科(上海)生命科學有限公司生產的核酸提取或純化試劑(磁珠法或離心柱法)進行核酸提取,請   按照試劑說明書進行操作。

2.試劑配制(試劑準備區)

根據待檢測樣本總數,設所需要的 PCR 反應管管數為 N(N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照;反應管數每滿 10 份,多配制 1 份),每測試反應體系配制如下表:

試劑PPMV-1 反應液酶液

用量19μL1μL

將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中,20μL/管。

3.加樣(樣本處理區)

將步驟 1 提取的核酸、陽性質控品、陰性質控品各取 5μL,分別加入相應的反應管中,蓋好管蓋,混勻,短暫離心。

4.PCR 擴增(核酸擴增區)

4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內;

4.2設置好通道、樣品信息,反應體系設置為 25μL;熒光通道選擇:檢測通道(Reporter Dye)FAM, 淬滅

通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光,選擇 None 即可。

4.3推薦循環參數設置:

步驟循環數溫度時間收集熒光信號

11 cycle50℃10min

21 cycle95℃2min

345 cycles95℃15sec

60℃30sec

5.結果分析判定

5.1結果分析條件設定(請參照各儀器使用說明書進行設置,以分析 ABI7500 儀器為例)

反應結束后自動保存結果,根據分析后圖像調節 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值(用戶可根據實際情況自行調整,Start 值可設在 3~15、End 值可設在 5~20,使閾值線位于擴增曲線指數期,陰性質控品的擴增曲線平直或低于閾值線),點擊 Analyze 自動獲得分析結果。

5.2結果判斷

陽性:檢測通道 Ct 值≤40,且曲線有明顯的指數增長曲線;陰性:樣本檢測結果 Ct 值>40 或無 Ct 值。

5.3質控標準

陰性質控品:無特異性擴增曲線或無 Ct 值顯示;陽性質控品:擴增曲線有明顯指數增長期,且 Ct 值≤32; 以上條件應同時滿足,否則實驗視為無效。

6.檢測方法的局限性

1.樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關;

2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會出現假陽性結果;

3.陽性對照、擴增產物泄漏,會導致假陽性結果;

4.病原體在流行過程中基因突變、重組,會導致假陰性結果;

5.不同的提取方法存在提取效率差異,會導致假陰性結果;

6.試劑運輸,保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降,出現假陰性或定量檢測不準確的結果;

7.本檢測結果僅供參考,如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】

1.所有操作嚴格按照說明書進行;

2.試劑盒內各種組分使用前應自然融化,完-全混勻并短暫離心;

3.反應液應避光保存;

4.反應中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區專用工作服;

6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行,以免交叉污染;

7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器;

8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待,并按照《微生物生物醫學實驗室生物安全通則》進行處理。

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優利科(上海)生命科學有限公司

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