甲型流感病毒 N6 亞型（IAV-N6）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）
【產品名稱】
商品名稱：甲型流感病毒 N6 亞型（IAV-N6）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）
Name ：Avian Influenza Virus subtype N6 Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規格】25T/盒、50T/盒
【預期用途】
甲型流感病毒（Influenza A virus）為常見流感病毒，甲型流感病毒最容易發生變異，甲型流感病毒的亞型則被人們稱為“禽-流感"，禽-流感(Bird Flu）是由禽-流感病毒引起的一種急性傳染病，病毒基因變異后能夠感染人類， 感染后的癥狀主要表現為高熱、咳嗽、流涕、肌痛等，多數伴有嚴重的肺炎，嚴重者心、腎等多種臟器衰竭導致死亡，病死率很高。此病可通過消化道、呼吸道、皮膚損傷和眼結膜等多種途徑傳播，人員和車輛往來是傳播本病的重要因素。本試劑盒利用實時熒光 PCR 原理，檢測 N6 亞型流感病毒，對甲型流感病毒 N6 亞型引起的流感診斷有重要指導意義。
【檢驗原理】
本試劑盒針對甲型流感病毒 N6 亞型 NA 基因高度保守區域設計特異性引物和探針，在反應體系中含甲型流感病毒 N6 亞型基因組模板的情況下，PCR 反應得以進行并釋放熒光信號。利用儀器對 PCR 過程中相應通道的信號強度進行實時監測和輸出，實現檢測結果的定性、定量分析。
【試劑組成】
包裝規格25T/盒50T/盒
IAV-N6 反應液500μL×1 管500μL×2 管
酶液25μL×1 管50μL×1 管
IAV-N6 陽性質控品50μL ×1 管50μL ×1 管
陰性質控品250μL ×1 管250μL ×1 管
說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數不超過 5 次，有效期 12 個月。
【適用儀器】
ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。
【標本采集】
拭子樣品：采集咽喉拭子時將拭子每人喉頭及上顎裂來回刮 2 次~3 次并旋轉，取分泌液；采集泄殖腔拭子時將拭子深人泄殖腔至少旋轉 3 圈并沾取少量糞便；將采樣后的拭子分別放入盛有 1.2 mL 樣品稀釋液（配制方法見 GB/T 18936-2020 高致病性禽-流感診斷技術）的 2 mL 采樣管中，編號并填寫相應采樣單。
發病禽鳥可無菌采集氣管、肺、腦、腸（包括內容物）、肝、脾、腎、心等組織臟器，裝入 15 mL 或 50 mL
帶螺口的有機材料保存管中，編號并填寫相應采樣單。
【保存和運輸】
采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應不超過 24 h；若需長期保存，應放置-70℃以下保存，凍融不超過 3 次。。
【使用方法】
1.樣品處理（樣本處理區）
1.1樣本前處理
將棉拭子充分捻動、擠干后棄去拭子；糞便，研碎的組織加 PBS 充分研磨，按照 1g 組織加 10 mL PBS 的比例配成懸液。樣品液經 3 000 r/min 離心 10 min，取上清作為核酸檢測材料。
1.2核酸提取
推薦采用公司生產的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進行核酸提取， 請按照試劑說明書進行操作。
2.試劑配制（試劑準備區）
根據待檢測樣本總數，設所需要的 PCR 反應管管數為 N(N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照；反應管數每滿 10 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：
試劑IAV-N6 反應液酶液
用量19μL1μL
將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，20μL/管。
3.加樣（樣本處理區）
將步驟 1 提取的核酸、陽性質控品、陰性質控品各取 5μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻， 短暫離心。
4.PCR 擴增（核酸擴增區）
4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內；
4.2設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；熒光通道選擇：
檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光， 選擇 None 即可。
4.3推薦循環參數設置：
步驟循環數溫度時間收集熒光信號
11 cycle50℃10min否
21 cycle95℃2min否
345 cycles95℃15sec否
60℃30sec是
5.結果分析判定
5.1結果分析條件設定（請參照各儀器使用說明書進行設置，以分析 ABI7500 儀器為例）
反應結束后自動保存結果，根據分析后圖像調節 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據實際情況自行調整，Start 值可設在 3～15、End 值可設在 5～20，使閾值線位于擴增曲線指數期，陰性質控品的擴增曲線平直或低于閾值線），點擊 Analyze 自動獲得分析結果。
5.2結果判斷
陽性：檢測通道 Ct 值≤40，且曲線有明顯的指數增長曲線； 陰性：樣本檢測結果 Ct 值>40 或無 Ct 值。
5.3質控標準
陰性質控品：無特異性擴增曲線或無 Ct 值顯示；
陽性質控品：擴增曲線有明顯指數增長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。
6.檢測方法的局限性
1.樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關；
2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現假陽性結果；
3.陽性對照、擴增產物泄漏，會導致假陽性結果；
4.病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；
5.不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；
6.試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現假陰性或定量檢測不準確的結果；
7.本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。
【注意事項】
1.所有操作嚴格按照說明書進行；
2.試劑盒內各種組分使用前應自然融化，完-全混勻并短暫離心；
3.反應液應避光保存；
4.反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區專用工作服；
6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行，以免交叉污染；
7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；
8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫學實驗室生物安全通則》進行處理。
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