【產(chǎn)品名稱】
商品名稱:豬圓環(huán)病毒通用型 (PCV-U)核酸檢測試劑盒(熒光 PCR 法)
Name:Porcine Circovirus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】50T/盒
【預(yù)期用途】
豬圓環(huán)病是由豬圓環(huán)病毒(Porcine Circovirus)引起豬的一種傳染性、先天性顫抖和斷奶仔豬多系統(tǒng)功能障礙性疾病。該病毒具有 PCV1 和 PCV2 兩種血清型,PCV1 無致病性。受 PCV2 感染的斷奶仔豬出現(xiàn)呼吸急促、困難、腹瀉、貧血、明顯的淋巴組織病變及進(jìn)行性消瘦。
本試劑盒適用于檢測肺、淋巴結(jié)組織、全血等樣本中的豬圓環(huán)病毒通用型,用于豬圓環(huán)病毒通用型感染的輔 助診斷。
【檢驗原理】
本試劑盒對豬圓環(huán)病毒基因保守區(qū)設(shè)計特異性引物和探針,用熒光 PCR 技術(shù)對豬圓環(huán)病毒通用型的 DNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測,用于科研上對可疑感染者的病原學(xué)檢測。
【試劑組成】
包裝規(guī)格50T/盒
PCV-U 反應(yīng)液500μL×2 管
酶液50μL×1 管
PCV-U 陽性質(zhì)控品 1.49×10^8拷貝/mL50μL ×1 管
陰性質(zhì)控品250μL ×1 管
說明:不同批號的試劑盒組分不可交互使用
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃避光保存,有效期 12 個月。避免反復(fù)凍融,凍融次數(shù)不超過 5 次;生產(chǎn)日期和失效日期見標(biāo)簽。
【適用儀器】
ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。
【標(biāo)本采集】
組織樣品采集:采取病死豬(包括流產(chǎn)的死胎))或撲殺豬主要臟器(淋巴結(jié)、脾臟、肺臟、腎臟和肝臟) 裝入滅菌 15 mL 離心管中,編號,送實(shí)驗室。血清樣品采集:用無菌注射器抽取受檢豬靜脈血不少于 5 ml,置于無菌離心管內(nèi),室溫或者 37℃傾斜放置自然凝集 20 min ~30 min,2 000 r/min~3 000 r/min 離心 10 min,吸取上清液到新的離心管內(nèi)備用。精液樣品采集:按照 GB/T 25172 的方法采集和保存精液。糞便樣品采集:取豬新鮮糞便 1 g,裝入 15 mI 滅菌離心管中,加入 5 mL PBS,混勻。細(xì)胞培養(yǎng)物:細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融 3 次,第 3 次解凍后,將細(xì)胞培養(yǎng)物置于 1.5 mL 無 DNA 酶的滅菌離心管內(nèi),編號備用。
【保存和運(yùn)輸】
采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過 24 h;若需長期保存,應(yīng)放置-70℃以下保存,凍融不超過 3 次。
【使用方法】
1.樣品處理(樣本處理區(qū))
1.1樣本前處理
組織樣品:取 1 g 解凍的組織,剪碎,加入 2 mL PBS 進(jìn)行研磨,制備組織勻漿,8000 r/min 離心 5 min,取上清用于后續(xù)的核酸提取。血清和精液樣品無需進(jìn)行前處理,直接用于核酸提取。糞便樣品:3000 r/min 離心 10 min,取上清液,轉(zhuǎn)入 1.5 mL 離心管中,用于后續(xù)的核酸提取。細(xì)胞培養(yǎng)物:4000 r/min,4℃離心 l0 min,取上清用于后續(xù)的核酸提取。
1.2核酸提取
推薦采用優(yōu)利科(上海)生命科學(xué)有限公司生產(chǎn)的核酸提取試劑(離心柱法)進(jìn)行核酸提取,請按照試劑說明 書進(jìn)行操作。
2.試劑配制(試劑準(zhǔn)備區(qū))
根據(jù)待檢測樣本總數(shù),設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照;反應(yīng)管數(shù)每滿 10 份,多配制 1 份),每測試反應(yīng)體系配制如下表:
試劑PCV-U 反應(yīng)液酶液
用量(樣本數(shù)為 N)19μL1μL
將混合好的測試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中,20μL 管。
3.加樣(樣本處理區(qū))
將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 5μL,分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中,蓋好管蓋,混勻,短暫離心。
4.PCR 擴(kuò)增(核酸擴(kuò)增區(qū))
4.1將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi);
4.2設(shè)置好通道、樣品信息,反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL;
熒光通道選擇:檢測通道(Reporter Dye)FAM, 淬滅通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列儀器請勿選擇 ROX
參比熒光,選擇 None 即可。
4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置:
步驟循環(huán)數(shù)溫度時間收集熒光信號
11 cycle95℃2min否
245 cycles95℃15sec否
60℃30sec是
5.結(jié)果分析判定
5.1結(jié)果分析條件設(shè)定(請參照各儀器使用說明書進(jìn)行設(shè)置,以分析 ABI7500 儀器為例)
反應(yīng)結(jié)束后自動保存結(jié)果,根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值(用戶可根據(jù)實(shí)際情況自行調(diào)整,Start 值可設(shè)在 3~15、End 值可設(shè)在 5~20,使閾值線位于擴(kuò)增曲線指數(shù)器,陰性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線平直或低于閾值線),點(diǎn)擊 Analyze 自動獲得分析結(jié)果。
5.2結(jié)果判斷
陽性:檢測通道 Ct 值≤40,且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線; 陰性:樣本檢測結(jié)果 Ct 值>40 或無 Ct 值。
5.3質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
陰性質(zhì)控品:無特異性擴(kuò)增曲線或無 Ct 值顯示;
陽性質(zhì)控品:擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)增長期,且 Ct 值≤32; 以上條件應(yīng)同時滿足,否則實(shí)驗視為無效。
6.檢測方法的局限性
1.樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān);
2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會出現(xiàn)假陽性結(jié)果;
3.陽性對照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏,會導(dǎo)致假陽性結(jié)果;
4.病原體在流行過程中基因突變、重組,會導(dǎo)致假陰性結(jié)果;
5.不同的提取方法存在提取效率差異,會導(dǎo)致假陰性結(jié)果;
6.試劑運(yùn)輸,保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降,出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果;
7.本檢測結(jié)果僅供參考,如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。
【注意事項】
1.所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行;
2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,完-全混勻并短暫離心;
3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存;
4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;
5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服;
6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行,以免交叉污染;
7.實(shí)驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器;
8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待,并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗室生物安全通則》進(jìn)行處理。
【參考文獻(xiàn)】
[1] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局. GB/T 35901-2018 豬圓環(huán)病毒 2 型熒光 PCR 檢測方法[S].
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