【產品名稱】
商品名稱:豬細小病毒(PPV)核酸檢測試劑盒(熒光 PCR 法)
Name :Porcine Parvovirus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規格】50T/盒
【預期用途】
豬細小病毒(Porcine parvovirus, PPV)是引起母豬流產和新生仔豬死亡的主要病原體之一,同時也能引起某些皮膚病和腹瀉。本試劑盒適用于檢測可疑豬組織器官、死胎及公豬精液等樣本中的豬細小病毒,用于豬細小病毒感染的輔助診斷。
【檢驗原理】
本試劑盒采用 TaqMan 探針法實時熒光 PCR 技術,設計一對豬細小病毒特異性引物,結合一條特異性探針, 用熒光 PCR 技術對豬細小病毒的 DNA 進行體外擴增檢測,用于科研上對可疑感染者的病原學檢測。
【試劑組成】
包裝規格50T/盒
PPV 反應液500μL×2 管
酶液50μL×1 管
PPV 陽性質控品50μL ×1 管
陰性質控品250μL ×1 管
說明:不同批號的試劑盒組分不可交互使用。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃,避光保存、運輸、反復凍融次數不超過 5 次,有效期 12 個月。
【適用儀器】
ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。
【標本采集】
取可疑豬組織器官、死胎,或公豬精液;
【保存和運輸】
采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應不超過 24 h;若需長期保存,應放置-70℃以下保存,凍融不超過 3 次。
【使用方法】
1.樣品處理(樣本處理區)
1.1樣本前處理
組織樣品:取可疑豬組織器官、死胎等 1g,研磨,加入 4mL 的樣品裂解液懸浮,凍融 3 次,5000r/min 離心 5min 取上清液。或將組織磨碎后,加入 4mL 含 10%小牛血清的 Hanks 液,凍融 3 次,5000r/min 離心 5min, 取上清備用。
公豬精液:采集 2mL 公豬精液,凍融 3 次備用。其他樣品前處理可參考 SN/T 1919-2016 [3]。
1.2核酸提取
推薦采用優利科(上海)生命科學有限公司生產的 核酸提取試劑盒(離心柱法)進行核酸提取,請按照試劑盒說明書進行操作。
2.試劑配制(試劑準備區)
根據待檢測樣本總數,設所需要的 PCR 反應管管數為 N(N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照;反應管數每滿 10 份,多配制 1 份),每測試反應體系配制如下表:
試劑PPV 反應液酶液
用量(樣本數為 N)19μL1μL
將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中,20μL/管。
3.加樣(樣本處理區)
將步驟 1 提取的核酸、陽性質控品、陰性質控品各取 5μL,分別加入相應的反應管中,蓋好管蓋,混勻,短暫離心。
4.PCR 擴增(核酸擴增區)
4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內;
4.2設置好通道、樣品信息,反應體系設置為 25μL;
熒光通道選擇: 檢測通道(Reporter Dye)FAM, 淬滅通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列儀器請勿選擇
ROX 參比熒光,選擇 None 即可。
4.3推薦循環參數設置:
步驟循環數溫度時間收集熒光信號
11 cycle95℃2min否
245 cycles95℃15sec否
60℃30sec是
5.結果分析判定
5.1結果分析條件設定(請參照各儀器使用說明書進行設置,以分析 ABI7500 儀器為例)
反應結束后自動保存結果,根據分析后圖像調節 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值(用戶可根據實際情況自行調整,Start 值可設在 3~15、End 值可設在 5~20,使閾值線位于擴增曲線指數期,陰性質控品的擴增曲線平直或低于閾值線),點擊 Analyze 自動獲得分析結果。
5.2結果判斷
陽性:檢測通道 Ct 值≤40,且曲線有明顯的指數增長曲線; 陰性:樣本檢測結果 Ct 值>40 或無 Ct 值。
5.3質控標準
陰性質控品:無特異性擴增曲線或無 Ct 值;
陽性質控品:擴增曲線有明顯指數增長期,且Ct 值≤32; 以上條件應同時滿足,否則實驗視為無效。
6.檢測方法的局限性
1.樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關;
2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會出現假陽性結果;
3.陽性對照、擴增產物泄漏,會導致假陽性結果;
4.病原體在流行過程中基因突變、重組,會導致假陰性結果;
5.不同的提取方法存在提取效率差異,會導致假陰性結果;
6.試劑運輸,保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降,出現假陰性或定量檢測不準確的結果;
7.本檢測結果僅供參考,如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。
【注意事項】
1.所有操作嚴格按照說明書進行;
2.試劑盒內各種組分使用前應自然融化,完-全混勻并短暫離心;
3.反應液應避光保存;
4.反應中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;
5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區專用工作服;
6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行,以免交叉污染;
7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器;
8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待,并按照《微生物生物醫學實驗室生物安全通則》進行處理。
【參考文獻】
[1]Mengeling W L. Prevalence of porcine parvovirus induced reproductive; an abattoir study [J]. Am Vet Med Assoc, 1978, 172: 1291-1294.
[2]Den S. Parvovirus-like particle associated with diarrhea in unweaned piglets [J]. Can Comp Med, 1985, 49: 343-345.
[3]國家質量監督檢驗檢疫總局. SN/T 1919-2016 豬細小病毒病檢疫技術規范[S].
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