【產品名稱】
商品名稱：豬附紅細胞體（SEP）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）
Name：Swine Eperythrozoon Detection Kit （Real-Time PCR Method)
【包裝規格】50T/盒
【預期用途】
豬附紅細胞體可引起豬出現發燒、皮膚及內臟器官出血、貧血、呼吸道癥狀及母豬繁殖障礙等癥狀，造成豬群生產性能下降，免疫力低下、死亡率增加。豬附紅細胞體可以引起豬群長期的持續性感染和潛伏感染，且易與其他病原混合感染，當與其他病原混合感染后可極大地增加患豬的死亡率，同時也增加了臨床上對該病的診斷難度。
本試劑盒適用于檢測全血等樣本中的豬附紅細胞體，用于豬附紅細胞體感染的輔助診斷。
【檢驗原理】
本試劑盒采用 TaqMan 探針法實時熒光 PCR 技術，設計豬附紅細胞體特異性引物和探針，用熒光PCR 技術對豬附紅細胞體的 DNA 進行體外擴增檢測，用于科研實驗中對可疑感染病料的病原學檢測。
【試劑組成】
包裝規格50T/盒
SEP 反應液500μL×2 管
酶液50μL×1 管
SEP 陽性質控品50μL ×1 管
陰性質控品250μL ×1 管
說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融不超過 5 次，有效期 12 個月。
【適用儀器】
ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。
【標本采集】
用注射器取血 5mL 至 EDTA-2Na 抗凝管
【保存和運輸】
采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應不超過 24 h；若需長期保存，應放置-70℃以下保存，凍融不超過 3 次。
【使用方法】
1.樣品處理（樣本處理區）
1.1樣本前處理
取抗凝血下層血細胞 50μL，加入 100μL 雙蒸水混勻
1.2核酸提取
推薦采用優利科（上海）生命科學有限公司生產的核酸提取試劑（離心柱法）進行核酸提取，請按照試劑說明書 進行操作。
2.試劑配制（試劑準備區）
根據待檢測樣本總數，設所需要的 PCR 反應管管數為 N（N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照；反應管數每滿 10 份，多配制 1 份），每測試反應體系配制如下表：
試劑SEP 反應液酶液
用量19μL1μL
將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，20μL/管。
3.加樣（樣本處理區）
將步驟 1 提取的核酸、陽性質控品、陰性質控品各取 5μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
4.PCR 擴增（核酸擴增區）
4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內；
4.2設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；
熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，請勿選擇 ROX 參比熒光。
4.3推薦循環參數設置：
步驟循環數溫度時間收集熒光信號
11 cycle95℃2min否
245 cycles95℃15sec否
60℃30sec是
5.結果分析判定
5.1結果分析條件設定（請參照各儀器使用說明書進行設置，以分析 ABI7500 儀器為例）
反應結束后自動保存結果，根據分析后圖像調節 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據實際情況自行調整，Start 值可設在 3～15、End 值可設在 5～20，使閾值線位于擴增曲線指數期，陰性質控品的擴增曲線平直或低于閾值線），點擊 Analyze 自動獲得分析結果。
5.2結果判斷
陽性：檢測通道 Ct 值≤40，且曲線有明顯的指數增長曲線； 陰性：樣本檢測結果 Ct 值>40 或無 Ct 值。
5.3質控標準
陰性質控品：無特異性擴增曲線或無 Ct 值顯示；
陽性質控品：擴增曲線有明顯指數增長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。
6.檢測方法的局限性
1.樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關；
2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現假陽性結果；
3.陽性對照、擴增產物泄漏，會導致假陽性結果；
4.病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；
5.不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；
6.試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現假陰性或定量檢測不準確的結果；
7.本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。
【注意事項】
1.所有操作嚴格按照說明書進行；
2.試劑盒內各種組分使用前應自然融化，完-全混勻并短暫離心；
3.反應液應避光保存；
4.反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區專用工作服；
6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行，以免交叉污染；
7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；
8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫學實驗室生物安全通則》進行處理。
【參考文獻】
[1]鄭麗艷. 豬附紅細胞體病診斷方法的研究[J]. 山東農業大學, 2006.
[2]于龍政. 豬附紅細胞體病 PCR 診斷方法的建立[J]. 延邊大學, 2006.
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