【產品名稱】
通用名稱:豬肺炎支原體(MHP)核酸檢測試劑盒(熒光 PCR 法)
Name:Mycoplasma hyopneumoniae Detection Kit(Real-Time PCR Method)
【包裝規格】25T/盒、50T/盒
【預期用途】
豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae, MHP)可引起豬支原體肺炎,該病又稱豬霉形體肺炎或豬氣喘病,是豬的一種高發性的慢性呼吸道傳染病,主要臨床表現為咳嗽和氣喘,病理變化以患豬肺心葉、尖葉的背側和橫隔葉的前端肉樣病變為特征[1]。該病一年四季均可發病,但以冬、春寒冷季節較常見,各種日齡豬均可發病。 病豬生長緩慢,飼料利用率低,給世界各國養豬業造成了重大經濟損失。
本試劑盒適用于檢測氣管分泌物拭子、肺組織等樣本中的豬肺炎支原體,用于豬肺炎支原體感染的輔助診斷。
【檢驗原理】
本試劑盒對豬肺炎支原體基因保守區設計特異性的引物和探針[2-3],用熒光 PCR 技術對豬肺炎支原體的DNA
進行體外擴增檢測,用于對可疑感染者的病原學診斷。
【試劑組成】
包裝規格25T/盒50T/盒
MHP 反應液500μL×1 管500μL×2 管
酶液25μL×1 管50μL×1 管
MHP 陽性質控品50μL ×1 管50μL ×1 管
陰性質控品250μL ×1 管250μL ×1 管
說明:不同批號的試劑盒組分不可交互使用。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃,避光保存、運輸、反復凍融次數不超過 5 次,有效期 12 個月。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。
【標本采集】
病死或撲殺豬,無菌采集肺病變部位或病變/非病變部位交界處的樣品;生豬滅菌棉拭子沾取氣管分泌物, 放入無菌試管中
【保存和運輸】
上述標本短期內可保存于-20℃,長期保存可置-70℃,但不能超過 6 個月,標本運送應采用 2~8℃冰袋運輸, 嚴禁反復凍融。
【使用方法】
1.樣品處理(樣本處理區)
1.1樣本前處理
組織樣品:每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g,手術剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨,加入
1.5mL 生理鹽水后繼續研磨,待勻漿后轉至 1.5mL 滅菌離心管中,8000rpm 離心 2min,取上清液 100μL 于 1.5mL
滅菌離心管中;棉拭子取 100μL 進行提取。
1.2 核酸提取
推薦采用優利科(上海)生命科學有限公司生產的核酸提取或純化試劑(磁珠法或離心柱法)進行核酸提取, 請按照試劑說明書進行操作。
2.試劑配制(試劑準備區)
根據待檢測樣本總數,設所需要的 PCR 反應管管數為 N(N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照;反應管數每滿 10 份,多配制 1 份),每測試反應體系配制如下表:
試劑MHP 反應液酶液
用量(樣本數為 N)20μL1μL
將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中,21μL/管。
3.加樣(樣本處理區)
將步驟 1 提取的核酸、陽性質控品、陰性質控品各取 4μL,分別加入相應的反應管中,蓋好管蓋,混勻,短暫離心。
4.PCR 擴增(核酸擴增區)
4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內;
4.2設置好通道、樣品信息,反應體系設置為 25μL;
熒光通道選擇: 檢測通道(Reporter Dye)FAM, 淬滅通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列儀器請勿選擇
ROX 參比熒光,選擇 None 即可。
4.3推薦循環參數設置:
步驟循環數溫度時間收集熒光信號
11 cycle95℃10min否
240 cycles94℃15sec否
55℃30sec是
5.結果分析判定
5.1結果分析條件設定
設置 Baseline 和 Threshold:一般直接按機器自動分析的結果分析,當曲線出現整體傾斜時,根據分析后圖像調節 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內調節)、stop 值(一般可在 5~20 范圍內調節),以及 Threshold的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照),重新分析結果。
5.2結果判斷
陽性:檢測通道 Ct 值≤35,且曲線有明顯的指數增長曲線;
可疑:檢測通道 35<Ct 值≤38,建議重復檢測,如果檢測通道仍為 35<Ct 值≤38,且曲線有明顯的增長曲線, 判定為陽性,否則為陰性;
陰性:樣本檢測結果 Ct 值>38 或無 Ct 值。
6.質控標準
陰性質控品:Ct>38 或無 Ct 值顯示;
陽性質控品:擴增曲線有明顯指數生長期,且 Ct 值≤32; 以上條件應同時滿足,否則實驗視為無效。
7.檢測方法的局限性
1.樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關;
2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會出現假陽性結果;
3.陽性對照、擴增產物泄漏,會導致假陽性結果;
4.病原體在流行過程中基因突變、重組,會導致假陰性結果;
5.不同的提取方法存在提取效率差異,會導致假陰性結果;
6.試劑運輸,保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降,出現假陰性或定量檢測不準確的結果;
7.本檢測結果僅供參考,如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。
【注意事項】
1.所有操作嚴格按照說明書進行;
2.試劑盒內各種組分使用前應自然融化,完-全混勻并短暫離心;
3.反應液應避光保存;
4.反應中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;
5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區專用工作服;
6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行,以免交叉污染;
7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器;
8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待,并按照《微生物生物醫學實驗室生物安全通則》進行處理。
【參考文獻】
[1]李瑩瑩,何穎, 趙武, 等。豬支原體肺炎研究進展[J]. 動物醫學進展, 2013,34(10): 95-100
[2]張旭, 白方方, 武昱孜, 等. PCR 技術檢測豬支原體肺炎的研究進展[J]. 生物技術通報, 2012(5): 54-60.
[3]Dubosson C R, Conzelmann C, Miserez R, et al. Development of two real-time PCR assays for the detection of Mycoplasma hyopneumoniae in clinical samples [J]. Veterinary microbiology, 2004, 11: 55-65.
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