【產(chǎn)品名稱】
商品名稱:豬瘟病毒(CSFV)核酸檢測試劑盒(熒光 PCR 法)
Name :Classical Swine Fever Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】50T/盒
【預期用途】 豬瘟是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)引起豬的以稽留高熱、皮膚和黏膜出現(xiàn)大量出血點為 主要特征的一種高度接觸性、致死性的傳染病[1],主要通過呼吸道和消化道傳染,傳播速度快, 發(fā)病率和病死 率高,給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[2],被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為必須報告的動物傳染病,被我 國農(nóng)業(yè)部列為一類動物疫病,是危害我國養(yǎng)豬業(yè)最嚴重的動物疫病之一。 本試劑盒適用于檢測的扁桃體、淋巴結(jié)等組織病變部與健康部交界處組織、全血等標本中豬瘟病毒 RNA, 適用于豬瘟病毒感染的輔助診斷。
【檢驗原理】 本試劑盒用一對豬瘟病毒特異性引物,結(jié)合一條特異性熒光探針,用一步法熒光 RT-PCR 技術(shù)對豬瘟病毒 RNA 進行體外擴增檢測,用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。
【試劑組成】 包裝規(guī)格 50T/盒 CSFV 反應液 500μL×2 管 酶液 50μL×1 管 CSFV 陽性質(zhì)控品 50μL ×1 管 陰性質(zhì)控品 250μL ×1 管 說明:不同批號的試劑盒組分不可交互使用。
【儲存條件及有效期】 -20℃±5℃,避光保存、運輸、反復凍融次數(shù)不超過 5 次,有效期 12 個月。 【適用儀器】 ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。
【標本采集】 病死或撲殺的豬,取扁桃體、淋巴結(jié)等組織病變部與健康部交界處組織;待檢活豬,用注射器取血 5mL。
【保存和運輸】 上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃,長期保存可置-70℃,但不能超過 6 個月,標本運送應采用 2~8℃冰袋運輸, 嚴禁反復凍融。
【使用方法】
1. 樣品處理(樣本處理區(qū))
1.1 樣本前處理 每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g,手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨,加入 1.5mL 生 理鹽水后繼續(xù)研磨,待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中,8000rpm 離心 2min,取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離 心管中;全血樣品待血凝后取血清 100μL,置 1.5mL 離心管中。
1.1 核酸提取 推薦采用優(yōu)利科(上海)生命科學有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑(磁珠法或離心柱法)進行核酸提取,請按照 試劑說明書進行操作。
2. 試劑配制(試劑準備區(qū)) 根據(jù)待檢測樣本總數(shù),設(shè)所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照;反應管 數(shù)每滿 10 份,多配制 1 份),每測試反應體系配制如下表: 試劑 CSFV 反應液 酶液 用量 20μL 1μL 將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中,21μL/管。
3. 加樣(樣本處理區(qū)) 將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL,分別加入相應的反應管中,蓋好管蓋,混勻,短 暫離心。
4. PCR 擴增(核酸擴增區(qū)) 4.1 將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內(nèi); 4.2 設(shè)置好通道、樣品信息,反應體系設(shè)置為 25μL;熒光通道選擇:檢測通道(Reporter Dye)FAM, 淬滅通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光, 選擇 None 即可。 4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置: 步驟 循環(huán)數(shù) 溫度 時間 收集熒光信號 1 1 cycle 42℃ 20min 否 2 1 cycle 95℃ 10min 否 3 40 cycles 94℃ 15sec 否 55℃ 30sec 是
5. 結(jié)果分析判定 5.1 結(jié)果分析條件設(shè)定 設(shè)置 Baseline 和 Threshold:一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析,當曲線出現(xiàn)整體傾斜時,根據(jù)分析后圖像 調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照),重新分析結(jié)果。
5.2 結(jié)果判斷 陽性:檢測通道 Ct 值≤35,且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線; 可疑:檢測通道 35<Ct 值≤38,建議重復檢測,如果檢測通道仍為 35
7. 檢測方法的局限性 1.樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān); 2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會出現(xiàn)假陽性結(jié)果; 3.陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏,會導致假陽性結(jié)果; 4.病原體在流行過程中基因突變、重組,會導致假陰性結(jié)果; 5.不同的提取方法存在提取效率差異,會導致假陰性結(jié)果; 6.試劑運輸,保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降,出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結(jié)果; 7.本檢測結(jié)果僅供參考,如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。
【注意事項】 1.所有操作嚴格按照說明書進行; 2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化,*混勻并短暫離心; 3.反應液應避光保存; 4.反應中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊; 5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服; 6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行,以免交叉污染; 7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器; 8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待,并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。
【參考文獻】 [1] Moennig V, Floegel-Niesmann G, Greiser-Wilke I. Clinical signs and epidemiology of classical swine fever: review of new knowledge [J]. Vet J, 2003, 165(1): 1-2. [2] Backer J A, Brouwer H, Schaik G, et al. Using mortality data for early detection of classical swine fever in the Netherlands [J]. Prev Vet Med, 2011, 99(1): 38-47. [3] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局. GB/T 27540-2011 鑒豬瘟病毒實時熒光 RT-PCR 檢測方法
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