A、血液樣本
有些生理因素,如吸煙、進食、運動、情緒波動、妊娠、體位等均可影響血液中某些成分的變化,有些甚至還有晝夜變化。因此血液標本的采集應盡量避免生理因素干擾,以條件一致為宜,如無法避免,應在標本上注明該因素。
1.外周血
一般選取左手無名指內側采血,該部位應無凍瘡,炎癥,水腫,破損。如該部位不符合要求,以其他手指部位代替。對燒傷病人,可選擇皮膚完整處采血。由于部分血液常規檢測(如白細胞計數、分類等)受生理因素影響波動過大,比較時宜使條件盡量一致。涉及到體內出、凝血功能的檢測項目(如血小板計數,出血時間或凝血時間等)的檢測,一定要注意了解患者是否用過抗凝、促凝藥物,以便在減少或避免干擾因素的影響。
2.靜脈血
除涉及各種止血和血栓檢測等項目需采用抗凝靜脈血血漿外,目前絕大多數檢測項目的分析檢測可直接采用靜脈血的血清。在血清檢測項目中,有些(如血糖,血脂等)受飲食及晝夜因素影響較大,一般以清晨空腹血標本為宜;有些在血中衰變較快(血清酶活性測定如ACP活性等),0~4℃貯存活性減弱也不一,這些項目的檢測必須及時而快速;有些(如肌酸激酶等)受運動等因素影響較大。抽血時避免溶血的發生也十分重要,尤其涉及血鉀,LDH等的測定。
B、尿液樣本
同血標本一樣,尿液標本受飲食、運動、藥物量等因素的影響也較大,特別是飲食的影響,故一般來說晨尿優于隨機尿。晨尿是指清晨起床后的第一次尿標本,較濃縮和酸化,有形成分(如血細胞,上皮細胞,管形)相對集中便于觀察。隨機尿即隨意一次尿,留取方便,但受飲食、運動、藥物影響較甚,易于出現假陽性和假陰性結果,如飲食性蛋白尿,飲食性糖尿,維生-素C干擾潛血結果等。餐后尿(午餐后2小時收集的患者尿液)適用于尿糖,尿蛋白和尿膽原的檢查,此時的尿標本可增加試驗敏感性,檢出較輕微的病變。12小時尿細胞計數即Addis計數(前晚8時排空膀胱后留取至次日晨8時的所有尿液),因時間較長,細菌易繁殖,須加入防腐劑甲醛。24小時尿(第一天晨8時排空膀胱后留取至次日晨8時的所有尿液)中化學物質的定量,包括蛋白,糖,尿17-酮、17-羥類固醇,兒茶酚胺,Ca2+等,檢測不同的物質,選擇不同的防腐劑防腐。清潔中段尿多用于尿細菌培養,要求無菌,沖洗外陰后留取標本。所有尿標本的收集都應足量,最少12 ml,最好50 ml,定時尿須全部收集,對女性患者應避免陰道分泌物、經血污染尿標本。
用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。
C、糞便樣本
糞便標本的檢測對判斷消化系統疾病有重要參考價值。采集時要求用干凈的竹簽選取含有粘液、膿血等異常病變成分的糞便,對外觀無異常的糞便須從表面、深處及糞端多處取材。找寄生蟲蟲體及作蟲卵計數應收集24小時糞便。查痢疾阿米巴滋養體應于排便后立即檢查,從有膿血和稀軟處取材,保溫送檢。查日本血吸蟲蟲卵時應取粘液、膿血部分,孵化毛蚴時至少留取30g糞便,且需盡快處理。檢查蟯蟲卵須用透明薄膜拭子于晚12時或清晨排便前自肛-門周圍皺襞處拭取并立即鏡檢。隱血試驗(化學法),試驗前3日禁食肉類及含動物血食物并禁服鐵劑,維生-素C等。所有糞便標本采集后1小時內應檢查完畢,以防止有形成分受消化酶及pH的破壞,來不及檢測的,應及時用PBS進行緩沖處理,離心去上清保存。
盡量采集干的糞便,糞便過稀會較難處理且降低檢測的準確性。采集的重量應大于 50 mg,將糞便用 PBS 洗 3 次(最終糞便質量:PBS 體積=1:9),用超聲粉碎(或搗碎)后于 5000×g 離心 10 分鐘,取上清檢測。
D、腦脊液樣本
腦脊液標本采集后立即送檢,放置過久將影響檢驗結果:如細胞變性,破壞,導致計數和分類不準;有些化學物質如葡萄糖等將分解含量減少;細菌發生自溶影響細菌的檢出率。腦脊液抽取后一般分裝三個無菌管,第一管作細菌培養,第二管作化學分析和免疫學檢查,第三管作一般性狀及顯微鏡檢查,三管的順序不宜顛倒。因標本采集較難,全部送檢和檢測過程應注意安全。
E、胸腹水樣本
與腦脊液標本一樣,采集后的標本注意安全,及時送檢。一般也分裝三管,一管作常規細胞學檢查,一管生化檢查,一管細菌培養,順序以與腦脊液相同為宜。
F、前列腺液樣本
前列腺液標本由前列腺按摩后采集,液量少時直接滴在載玻片上及時送檢,須注意防止標本蒸干,量多時收集在潔凈干燥的試管中。若按摩不出前列腺液,可檢查按摩后的尿液沉渣。
G、精液樣本
精液標本采集前應禁欲3~7天,排凈尿液后可用手淫法或其他方法將精液直接排入干凈的容器中,保溫并及時送檢。由于精-子生成日間變動較大,一般應檢查2~3次(每次間隔1~2周)方可做診斷。
將精液收集于無菌容器中,正常精液射出體外呈稠厚的膠凍狀,射出體外后需在室溫或 37 度水浴箱中使其在前列腺分泌的纖維蛋白溶解酶的作用下液化,變的稀薄。待精液*液化后,將精液 4000 rpm 離心 10 分鐘分離精漿進行檢測。
H、陰道分泌物樣本
陰道標本采集前24小時應禁止房事、盆浴、陰道檢查、陰道灌洗及局部上藥等,取材所用器械需清潔。一般用鹽水浸濕的棉拭子自陰道深部或陰道穹后部、宮頸管口等處取材,制成生理鹽水涂片后觀察陰道分泌物標本,經期的女性患者不宜檢查陰道分泌物標本。
(二) ELISA的樣本實驗準備
在收集樣本前都必須有一個完整的計劃,必須清楚要檢測的成份是否足夠穩定。對收集后當天就進行
檢測的樣本,及時儲存在4℃備用。對于隔天再檢測的樣本,及時分裝后凍存在-20℃備用,有條件的,最好-70℃凍存備用。標本應避免反復凍融。
液體類標本: 包括血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液、細胞培養上清等。
1. 血清:
室溫血液自然凝固10-20分鐘后,離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。
2. 血漿:
應根據標本的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑,混合10-20分鐘后,離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。
3. 尿液:
用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。胸腹水、腦脊液參照此實行。
4. 細胞培養上清:
檢測分泌性的成份時,用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清。
5. 培養細胞
檢測細胞內的成份時,用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細胞懸液,細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融或加入組織蛋白萃取試劑,以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。
6. 組織標本
切割標本后,稱取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS(PH7.4),或組織蛋白萃取試劑, 用手工或勻漿器將標本勻漿化。離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清。分裝后一份待檢
測,其余冷凍備用。
取牛奶10ml入離心管,加入10ml乙酸乙酯,超聲震蕩30min。
然后4000g離心10min(如兩相之間出現乳化層,則將樣品瓶放在80℃的水浴中約5min,再離心)移取1ml乙酸乙酯層至另外試管中,60℃氮氣流下蒸干,殘留物用緩沖液2ml緩沖后備用,前處理過程約需2小時。
取10ml牛奶10℃3500G離心10MIN,祛除上層脂肪,取5ml脫脂奶粉加入150微升17.2%亞鐵氰-化鉀,出現沉淀,漩渦混合,然后加入150微升53.5%硫酸鋅。再次漩渦混合。15攝氏度3500g離心10分鐘,取上層清液用緩沖液1:2稀釋待用,前處理過程所需1小時。
處理樣本的過程就是收集目標蛋白的過程,由于蛋白容易變性,降解,故該過程應盡量溫和。樣本處理之后的儲存也非常重要,尤其注意不要反復凍融,樣本處理之后可分裝密封保存,4 度保存應小于 1 周,-20 度不應超過 1 個月,-80 度不應超過 2 個月。在標本使用前應緩慢均衡至室溫,不應加熱使之融解。樣本的處理是實驗成功的第一步
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