使用方法
一、稀釋標準曲線樣品(以 10E1-10E6 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例)。 由于標準品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行,千萬不能 污染樣品或本試劑盒的其他成分。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原,本 產品不提供活體樣品做陽性對照,只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。
1.標記 6 個離心管,分別為 6,5,4,3,2,1。
2.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液,最好用帶芯槍頭, 下同。
3. 在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供),充分震 蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭,在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭,在 4 號管中加入 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E4 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備
7. 如果有 N 個樣品待提取,最好設置 N+2 個提取,多出的是 PC(樣品制備陽 性對照)和 NC(樣品制備陰性對照)。可以取陽性對照的 1000 倍稀釋液 10μL 再加上一定量的水,使總體積與待提取樣品的規定體積一致,以此作 為 PC。另外用水作為 NC。
8. 用自選方法純化樣品的 DNA,本試劑盒跟市場上大多數 DNA 提取試劑盒兼 容。
三、Probe qPCR 反應(20μL 體系,在樣品制備室進行)
9.如果做定量分析并且只做 1 次重復,則標記 N+9 個 PCR 管,其中 N+2 個 用于上步得到的 N+2 個樣品,1 個用于 PCR 陰性對照(用水做模板),6 個用于標準曲線。如果做定性分析,并且只做 1 次重復,則標記 N+4 個 PCR 管,其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,1 個用于 PCR 陰性對照(用 水做模板),1 個用于 PCR 陽性對照(用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模 板)。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設 置完畢后才設置陽性對照,并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好 后最后加)
成分/每管 | 樣品管 N+2 個 | PCR 陰性 對照管 | 標準曲線 樣品管(1-6 管) |
2×Probe qPCR MagicMix | 10 μL | 10 μL | 10 μL |
榛子源性成分探針法 qPCR 引物-探針混合液 | 3 μL | 3 μL | 3 μL |
N+2 個待測 DNA 模板 | 7 μL | ||
超純水 | 7 μL | ||
第 6 步所得標準曲線樣品稀釋液 (1-6 號) | 7 μL(1 號樣到 1 號管,2 號樣到 2 號管…) |
11. 蓋上蓋子后上機,按下面參數進行 PCR:
過程 | 溫度 | 時間 |
預變性 | 95℃ | 10 min |
PCR 反應 (45 個循環) | 95℃ | 15 sec |
60℃ | 60 sec(采集 FAM 通道的熒 光信號) |
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