1.在 0.02-1 mL 新鮮或抗凝血液(冷凍血需先 37℃水浴融化)中加入 0.5 mL紅細(xì)胞裂解液(A 型),吹打混勻。
注意:溶液 A 非常容易長菌,取用需要在無菌條件下進(jìn)行。
a) 哺乳動物,血液使用量以 300 uL 以下為宜,使用量越大產(chǎn)量越高,但產(chǎn)率會降低。如果血液多于 300 uL,重復(fù) 1-2 步兩次可以提高產(chǎn)率。
b) 禽類動物,血液使用量以 20 uL 以下為宜,可以從第 3 步做起。
2. 室溫 12,000-15,000 rpm 離心 5 分鐘,沉淀呈粉紅色,小心傾去上清。
3. 再短暫離心半分鐘,吸棄殘留的液體。此步有利于后面的細(xì)胞裂解,但一般可以省略。
4. 向有沉淀的離心管內(nèi)加入 0.5 mL 溶液 A(溶液 A 有少量晶體沉淀,用前需要搖晃均勻),用移液槍吹打使沉淀充分懸浮起來。此步目的是裂解細(xì)胞,釋放 DNA,所以吹打越充分越好。
5. 靜置 2 分鐘待溶液變清亮后,將液體轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中并靜置 2-5 分鐘,以使 DNA 與膜充分結(jié)合。
6. 12,000 rpm 離心半分鐘,DNA 將吸附到膜上,棄收集管中的廢液。
7. 加入 0.7 mL 的通用洗柱液,12,000 rpm 離心半分鐘,棄收集管中的廢液。
8. 加入 0.3 mL 的通用洗柱液,12,000 rpm 離心半分鐘,棄收集管中的廢液。
9. 12,000 rpm 離心半分鐘,甩干殘留液體。此步很重要,以去除膜上殘留通用洗柱液,否則會影響后續(xù)反應(yīng)。
10.將離心吸附柱置于一新的 1.5 mL 塑料離心管(自備)中,加入適量 30-100uLDNA 洗脫液 2.0,室溫放置 2 分鐘。如果將 DNA 洗脫液 2.0 在 65℃預(yù)熱后再使用,洗脫 DNA 的效果會更好。
11. 12,000 rpm 離心半分鐘,離心管底溶液即 DNA 溶液。可以立即使用或放冰箱長期保存。
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