PCR可以被認為是與發生在細胞內的DNA復制過程相似的技術,其結果都是以原來的DNA為模板產生新的互補DNA片段。細胞中DNA的復制是一個非常復雜的過程。參與復制的有多種因素。PCR是在試管中進行的DNA復制反應,基本原理與細胞內DNA復制相似,但反應體系相對較簡單。
PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成:
①模板DNA的變性:模板DNA經加熱至94℃左右一定時間后,使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結合,為下輪反應做準備;
②模板DNA與引物的退火(復性):模板DNA經加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合;
③引物的延伸:DNA模板--引物結合物在Taq酶的作用下,以dNTP為反應原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復制原理,合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈。
重復循環變性--退火--延伸三過程,就可獲得更多的“半保留復制鏈",而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2~4分鐘,2~3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。
熒光PCR如何實現實時監控的呢?
1、PCR反應體系中加入熒光染料。
2、所有的定量PCR儀器都有三個共同的組成部分(檢測器、激發光源、熱循環模塊)。
3、在擴增過程中,熒光信號隨著PCR產物的增加而增強。
4、每個循環結束后,定量PCR儀器通過光學系統記錄熒光信號的增加。
5、PCR軟件計算出數據,用于實驗結果的分析ARMS檢測方法;1個SNP位點設計雙管反應,含目的基因檢測及內參檢測雙通道。
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