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細胞株和菌株【豬靜脈血管內(nèi)皮細胞】注意事項

閱讀:903      發(fā)布時間:2023-3-29
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細胞株和菌株【豬靜脈血管內(nèi)皮細胞】注意事項:

1.實驗進行前,無菌室及無菌操作臺(laminar flow) 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌,以70 %ethanol 擦拭無菌操作抬面,并開啟無菌操作臺風(fēng)扇運轉(zhuǎn)10 分鐘后,才開始實驗操作。每次操作只處理一株細胞株,且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基,以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢后,將實驗物品帶出工作臺,以70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面。操作間隔應(yīng)讓無菌操作臺運轉(zhuǎn)10 分鐘以上后,再進行下一個細胞株之操作。

2. 無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞,必要物品,例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置,其它實驗用品用完即應(yīng)移出,以利于氣流之流通。實驗用品以70 % ethanol 擦拭后才帶入無菌操作臺內(nèi)。實驗操作應(yīng)在抬面之中央無菌區(qū)域,勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作。3. 小心取用無菌之實驗物品,避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口,亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后,以手夾住瓶蓋并握住瓶身,傾斜約45° 角取用,盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。

4. 工作人員應(yīng)注意自身之安全,須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗。對于來自人類或是病毒感染之細胞株應(yīng)特別小心操作,并選擇適當?shù)燃壷疅o菌操作臺(至少Class II)。操作過程中,應(yīng)避免引起aerosol 之產(chǎn)生,小心****,例如DMSO TPA 等,并避免尖銳針頭之傷害等。

5. 定期檢測下列項目:5.1. CO2 鋼瓶之CO2 壓力5.2. CO2 培養(yǎng)箱之CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水,每周更換)5.3. 無菌操作臺內(nèi)之airflow 壓力,定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜,預(yù)濾網(wǎng)(300小時/預(yù)濾網(wǎng),3000 小時/HEPA)

6. 水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750),定期更換水槽的水。


請問工作濃度的胰酶是不是應(yīng)保存在-20度?如果放在4度冰箱可以保存多久呢?是不是幾個小時就會失去活性?

平時放在-20度,分裝在50毫升螺口管,用時拿一管放4度用。

1. 認真按照操作規(guī)程進行實驗,一般不大會導(dǎo)致污染,很多情況下是由于所用的試劑或培養(yǎng)基有污染而使實驗失敗,

2. 粉末培養(yǎng)基配制好后(加了血清),一般在4度盡量不要超過1個月,如在-20度存放時間可長一些,但最好也不要超過3-4個月,可能對于永生化細胞株來說要求不是太高,但我在過去的4年里一直是作原代細胞培養(yǎng)的,細胞嬌弱,經(jīng)驗表明放置時間不宜過長。

3. 關(guān)于實驗用品的清洗與消毒,我的經(jīng)驗是:用過的玻璃器皿先在清水中浸泡30min以上,然后加少許清洗劑,以超聲波洗滌30min左右,(如無超聲波洗滌器可用軟毛刷輕輕刷洗干凈),撈出晾干,再在鉻酸洗液中浸泡6-18h(或過夜)后,自來水清洗10-15遍,雙蒸水清洗3-4遍,晾干,高壓消毒后即可使用。  

許多塑料制品也可以高壓消毒,例如培養(yǎng)瓶蓋,膠塞,吸頭等。不能用于高壓的一般均已制成一次性作用的商品了,當然如果money有限,如進口的培養(yǎng)板、皿等,也可以重復(fù)使用1-2次,我當時使用方法是將其wan全清潔后,使用前在紫外燈下敞開照射1-1.5h即可,我做過多次,沒有出現(xiàn)問題。塑料培養(yǎng)瓶由于清洗消毒不便,最好不要重復(fù)使用,如一定要重復(fù)用,可用環(huán)氧乙烷等消毒,(消毒后一定要放置半年以上方可使用)

在光鏡下,上皮細胞通常呈“鋪路石"樣排布,細胞之間有拉絲現(xiàn)象(即距離較遠的細胞可以通過細長的觸手相連),細胞有成片生長的特性。而間質(zhì)細胞通常呈梭形,沒有有成片生長的特性,細胞之間的聯(lián)系不緊密。但是細胞的形態(tài)特征會因為生長條件的改變而改變,如HeLa細胞是上皮細胞,但是在酸性培養(yǎng)條件下會變?yōu)樗笮巍?/span>

上皮細胞之間都有特征性的緊密連接(橋粒)結(jié)構(gòu),因此可以通過觀察培養(yǎng)細胞的超微結(jié)構(gòu)來判斷細胞的類型,如果有緊密連接,就必然是上皮細胞。這是一錘定音的證據(jù)。注意不要把細胞消化下來做電鏡,要用細胞刮刮下來后做電鏡。 此外每一種上皮細胞都有其特征的細胞角蛋白的表達(cytokertin, CK,可以查一下子宮內(nèi)膜腺上皮細胞表達的CK分子,然后進行免疫細胞化學(xué)的鑒定。

細胞在偏堿的情況下培養(yǎng),耐受能力會逐漸下降,可能是產(chǎn)生脫壁現(xiàn)象的原因,后來我重新測了一下培養(yǎng)基,為7.5左右,我用滅菌的HCL調(diào)了一下,培養(yǎng)基顏色變成淡紅透亮,再次培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)細胞貼壁比較好了,搏動效果也不錯,因此,我以后每次培養(yǎng)前都要重新調(diào)好PH值,我覺得很多因素是能影響PH值的。

血清質(zhì)量不好,影響了細胞生長。所以,我認為以后養(yǎng)細胞,用的血清濃度最好是每批次血清都摸一下,不一定要以參考文獻為準,畢竟國產(chǎn)的血清質(zhì)量差異比較大啊。

細胞無菌操作是關(guān)鍵,對于配制培養(yǎng)液時,有些人為了讓培養(yǎng)粉充分溶解,攪拌4小時或更長時間。其實這wan全沒有必要,一般培養(yǎng)基的固體組分還是易溶于水的,攪拌的時間長了會增加污染機會,雖然后來濾過除菌了,但細菌的代謝產(chǎn)物比如脂多糖誰能夠把它濾掉?細菌的代謝是很快的,甚至在常溫下20min就可以繁殖一代,太可怕了。我的經(jīng)驗就是攪拌30min-60min就把它過濾。

另外關(guān)于培養(yǎng)基的pH問題,一般按照說明書操作,加入所說的NaHCO3量,與預(yù)計的pH不會有什么距離,也就是說基本上不用調(diào)pH,如果相差大,要考慮三蒸水的質(zhì)量是否有所下降,當然這時調(diào)pH也是不得已而為之。我配培養(yǎng)基時基本上不調(diào)pH,只是用試紙檢測一下pH,觀察一下培養(yǎng)基的顏色。

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