PCR可以被認為是與發生在細胞內的DNA復制過程相似的技術,其結果都是以原來的DNA為模板產生新的互補DNA片段。細胞中DNA的復制是一個非常復雜的過程。參與復制的有多種因素。PCR是在試管中進行的DNA復制反應,基本原理與細胞內DNA復制相似,但反應體系相對較簡單。
PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成:
①模板DNA的變性:模板DNA經加熱至94℃左右一定時間后,使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結合,為下輪反應做準備。
②模板DNA與引物的退火(復性):模板DNA經加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合。
③引物的延伸:DNA模板--引物結合物在Taq酶的作用下,以dNTP為反應原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復制原理,合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈。
重復循環變性--退火--延伸三過程,就可獲得更多的“半保留復制鏈",而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2~4分鐘, 2~3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。
注意事項:
1.所有操作嚴格按照說明書進行。
2.試劑盒內各種組分使用前應自然融化,混勻并短暫離心。
3.反應液應避光保存。
4.反應中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊。
5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區專用工作服。
6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行,以免交叉污染。
7.實驗完畢后用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器。
8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待,并按照《微生物生物醫學實驗室生物安全通則》進行處理。
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