試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。往預先包被超敏C反應蛋白(hs-CRP)抗體的包被微孔中,依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體,經過溫育并洗滌。用底物TMB顯色,TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的超敏C反應蛋白(hs-CRP)呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度(OD 值),計算樣品濃度。
試劑的準備:
20×洗滌緩沖液的稀釋:蒸餾水按1:20稀釋,即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。
洗板方法:
1、手工洗板:甩盡孔內液體,每孔加滿洗滌液,靜置1min后甩盡孔內液體,在吸水紙上拍干,如此洗板5次。
2、自動洗板機:每孔注入洗液350μL,浸泡1min,洗板5次。
操作步驟:
1、從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2、設置標準品孔和樣本孔,標準品孔各加不同濃度的標準品50μL;
3、樣本孔先加待測樣本10μL,再加稀釋液40μL;空白孔不加。
4、除空白孔外,標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100μL,用封板膜封住反應孔,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5、棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復洗板5次(也可用洗板機洗板)。
6、每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。
7。每孔加入終止液50μL,15min內,在450nm波長處測定各孔的OD值。
結果判斷:
繪制標準曲線:在Excel工作表中,以標準品濃度作橫坐標,對應OD值作縱坐標,繪制出標準品線性回歸曲線,按曲線方程計算各樣本濃度值。
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