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丙酮酸脫氫酶（Pyruvate dehydrogenase，PDH）試劑盒
注意：正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定
規格: 100 管/96 樣
產品內容：
試劑一：100mL×1 瓶，-20℃保存； 試劑二：20mL×1 瓶，-20℃保存； 試劑三：1.5mL×1 支，-20℃保存； 試劑四：液體 20mL×1 瓶，4℃保存； 試劑五：粉劑×1 瓶，4℃保存；
產品說明：PDH（EC 4.1.1.1）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，是丙酮酸脫氫酶復合體(PDHC)
催化丙酮酸氧化脫羧的限速酶，催化丙酮酸脫梭生成羥-乙基-TPP，把糖酵解和三羧酸循環連接起來。
PDH 催化丙酮酸脫氫，同時還原 2,6-二氯酚靛酚（2,6-DCPIP），從而導致 600nm 光吸收的減少。
需自備的儀器和用品
可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本的前處理
組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
1、 稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬細胞，加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2、 將勻漿 600g，4℃離心 5min。
3、 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。
4、 上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的 PDH（此步可選做）。
5、 在步驟 4 的沉淀中加入 200uL 試劑二和 2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W， 超聲 3 秒，間隔 10 秒，重復 30 次），用于線粒體 PDH 活性測定。
二、測定步驟
1、 分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 605nm，蒸餾水調零。
2、 樣本測定
（1） 在試劑五中加入 19mL 試劑四充分溶解，置于 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴10min；用不完的試劑 4℃保存一周；
（2） 在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 樣本和 190μL 試劑五，混勻，立即記錄 605nm 處初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2，計算ΔA=A1-A2。
三、PDH 活性計算
a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下
（1） 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。
PDH 活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=952×ΔA÷Cpr
（2） 按樣本鮮重計算
單位的定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。
PDH 活性（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=192×ΔA÷W
（3） 按細菌或細胞密度計算
單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。
PDH 活性（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.385×ΔA
V 反總：反應體系總體積，2×10-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數，2.1×104 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 mL；V 樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500 萬。
b. 用 96 孔板測定的計算公式如下
（1） 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。
PDH 活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1904×ΔA÷Cpr
（2） 按樣本鮮重計算
單位的定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。
PDH 活性（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T=384×ΔA÷W
（3） 按細菌或細胞密度計算
單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。
PDH 活性（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.77×ΔA
V 反總：反應體系總體積，2×10-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數，2.1×104 L / mol /cm；d：96 孔板光徑，0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 mL；V 樣總：加入提取液體積，0.202mL；T：反應時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500 萬。
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