蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)的時(shí),有時(shí)候?qū)嶒?yàn)會(huì)覺得參考實(shí)驗(yàn)方法和克隆的蛋白基因序列wan全沒有問題,但蛋白電泳就是沒有結(jié)果。下面讓我們一起來看看蛋白表達(dá)的常見問題有哪些吧!
1、載體構(gòu)建錯(cuò)誤,很多克隆新人經(jīng)常弄錯(cuò)讀碼框。比如Qiagen的pQE系列載體,其克隆位點(diǎn)常有一兩個(gè)堿基的區(qū)別;另外有些酶產(chǎn)生粘端有些酶產(chǎn)生平端,這些都容易導(dǎo)致讀碼框錯(cuò)誤,從而表達(dá)不出來。
2、宿主菌選擇不當(dāng),不同的宿主菌其基因型是不一樣的。有些經(jīng)過特殊修飾的載體,或者特殊用途的載體,或者有特殊啟動(dòng)子的載體,必須選擇合適的宿主菌進(jìn)行表達(dá)。因此,當(dāng)你的蛋白沒有表達(dá)出來時(shí),可以考慮更換宿主菌。
3、密碼子的使用頻率低。有些基因其本身含有許多稀有密碼子,尤其是起始密碼之后的15個(gè)堿基之內(nèi)的稀有密碼子,對(duì)蛋白表達(dá)有著很重要的影響。優(yōu)化密碼子對(duì)原核表達(dá)似乎效果很好,對(duì)真核表達(dá)系統(tǒng)未見得有很好的效果。
4、質(zhì)粒不穩(wěn)定或者質(zhì)粒丟失。pET系統(tǒng)通常比較穩(wěn)定。但是你選用帶氨芐青霉素抗性的載體時(shí),也許有可能產(chǎn)生β-lactamase降解了抗生素,使質(zhì)粒丟失。還有一種情況是表達(dá)重組的毒素蛋白,對(duì)宿主細(xì)胞也有毒性,造成質(zhì)粒丟失。這種情況多見于真核表達(dá)系統(tǒng)。
5、蛋白酶將蛋白降解了。這種情況常由重組蛋白本身的N-或C-端序列引起的。當(dāng)?shù)鞍?/span>N-端是Arg, Leu, Lys, Phe, Trp,或 Tyr這些氨基酸時(shí),容易遭受蛋白酶降解,此即N-末端規(guī)則。N-端是Met時(shí),大腸桿菌可以悄悄地把這個(gè)Met偷走,特別是Met后緊跟著一個(gè)帶小側(cè)鏈的氨基酸時(shí)。C-末端存在非極性氨基酸時(shí),也容易導(dǎo)致蛋白被降解。C末端最后5個(gè)氨基酸是極性的或者帶電荷的,則不易被降解。
6、二級(jí)翻譯起始位點(diǎn)。這種情況見于你的序列里正好含有和核糖體結(jié)合位點(diǎn)wan全一致的序列。那就怪不得人家了,核糖體會(huì)很高興地找到這個(gè)位點(diǎn),然后開始翻譯,致使你的蛋白被截短,在電泳時(shí)看不到預(yù)期大小的片段。
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