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BCA法實(shí)驗(yàn)原理、操作步驟

閱讀:530      發(fā)布時(shí)間:2024-9-25
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一、實(shí)驗(yàn)原理

BCA(bicinchoninic acid,二辛可酸)法,測(cè)定蛋白質(zhì)即在堿性條件下蛋白質(zhì)與Cu2+絡(luò)合,并將其還原成Cu1+Cu1+BCA試劑反應(yīng),使其由原來(lái)的蘋果綠形成穩(wěn)定的紫藍(lán)色復(fù)合物,在562 nm有強(qiáng)烈的光吸收,且吸光值和蛋白質(zhì)濃度在廣泛范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系,因此可用于蛋白質(zhì)濃度測(cè)定。

?二、操作步驟

準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品和樣品?:將標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(如牛血清白蛋白BSA)稀釋成一系列已知濃度的溶液,作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí),將待測(cè)樣品適當(dāng)稀釋,確保其在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)。

配制BCA工作液?:根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量,按照50體積的試劑A1體積的試劑B的比例配制適量的BCA工作液。例如,如果測(cè)定4個(gè)樣品,每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔,則需要配制12200μL的工作液。

?加樣?:在96孔板的相應(yīng)孔中加入20μL的標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品,然后加入PBS或其他緩沖液至總體積為20μL

?加入BCA工作液?:向每個(gè)孔中加入200μLBCA工作液,輕輕混勻。

孵育?:將酶標(biāo)板放在37℃孵育30分鐘,或者室溫下孵育2小時(shí),使反應(yīng)wanquan。

測(cè)定吸光度?:使用酶標(biāo)儀在562nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的吸光度。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算樣品濃度?:將標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度和對(duì)應(yīng)的濃度繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后,將待測(cè)樣品的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出樣品的蛋白質(zhì)濃度。

BCA法實(shí)驗(yàn)原理、操作步驟

三、注意事項(xiàng)

確保所有操作在無(wú)菌條件下進(jìn)行,避免污染。

每次測(cè)定最好制作新的標(biāo)準(zhǔn)曲線,因?yàn)?/span>BCA反應(yīng)可能會(huì)受溫度和時(shí)間的影響。

為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性,每個(gè)樣品應(yīng)設(shè)置至少3個(gè)復(fù)孔,并取平均值進(jìn)行計(jì)算。

注意試劑的保存條件和有效期,確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

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