上期小奧課堂和大家講了《ELISA方法學開發實踐版-生物大分子檢測的定量方法開發》。
本期小奧再和大家分享另一個重要話題：《ELISA方法學開發實踐版-親和力測定方法開發》。

一、前言

目前用于測定受體配體間的親和力，也就是解離平衡常數的方法，主要有：

1. 熱力學測定方法
2. 動力學測定方法
3. 飽和濃度法

其中動力學測定方法和飽和濃度法較為通用：動力學測定方法（如Biacore）涉及到比較昂貴的儀器投入，飽和濃度測定法為國內絕大多數生物藥物企業常用的測定方法。

ELISA用于親和力的測定是飽和濃度測定法的主流模式，常用于抗原蛋白或者抗體的蛋白水平的活性評估和抗體的穩定性評價等。
ELISA用于親和力測定往往沒有商業化的試劑盒，需要實驗人員進行方法學開發。

由于生物技術這方面教育缺失和新藥研發企業在此應用的積累不夠，一個能夠通過方法學驗證的ELISA親和力測定方法對于很多從業人員來說是一件難度較大的事情，而且很有可能出現謬誤如新號傳遞錯誤或者偏差等。
其中的一個謬用是采取ELISA定量的實驗條件進行ELISA親和力測定方法的開發。

本文從親和力的測定方法的基本原理入手，描述飽和濃度法親和力測定的基本原則，概述ELISA方法開發過程中的抗原抗體的劑量關系，以及在ELISA用于親和力測定方法應用時可能會出現的幾個錯誤，并為大家介紹通用的親和力測定的方案和初步的方法學開發的方案。

二、親和力基本概念

我們通過分析幾個化學反應案例，和大家解釋一下什么叫做親和力。

 例子A 
氫氣和氧氣在點燃的條件下生成水。
在反應停止時，如果在反應環境中氫氣的摩爾濃度恰巧是氧氣的摩爾濃度的2倍時，兩者皆被消耗，反應環境中只有水；如果氫氣的摩爾濃度大于氧氣的摩爾濃度的2倍時，氧氣被消耗，反應環境中只有氫氣和水；果氫氣的摩爾濃度小于氧氣的摩爾濃度的2倍時，氫氣被消耗，反應環境中只有氧氣和水。
這是關于化學反應的基礎知識，化學反應進行的結果，反應物能夠變為生成物，即反應能進行到底，有此類反應的過程和結果特性的反應稱之為不可逆反應。

 例子B 
PD1抗原（CD279）和PD1抗體（如pembrolizumab）在常溫常壓下反應。
在反應停止時，如果反應環境中CD279的摩爾濃度為200nM, pembrolizumab的摩爾濃度是100nM時，在理想條件下pembrolizumab-CD279復合物的濃度為97.86nM, CD279的摩爾濃度為4.28nM, pembrolizumab為2.14nM; 
如果反應環境中CD279的摩爾濃度為100nM, pembrolizumab的摩爾濃度是200nM時，在理想條件下pembrolizumab-CD279復合物的濃度為49.81nM, CD279的摩爾濃度為0.38nM, pembrolizumab為159.19nM。

 例子C 
PD1抗原（CD279）和PDL1抗原（CD274）在常溫常壓下反應。
如果反應環境中CD279的摩爾濃度為200nM, CD274的摩爾濃度是100nM時，在反應完成時理想條件下CD274-CD279復合物的濃度為2.35nM, CD279的摩爾濃度為197.65nM，CD274的摩爾濃度是97.65nM；
如果反應環境中CD279的摩爾濃度為100nM, CD274的摩爾濃度是200nM時，在反應完成時理想條件下CD274-CD279復合物的濃度為2.35nM, CD279的摩爾濃度為97.65nM，CD274的摩爾濃度是197.65nM，絕大多數CD279和CD274并未參與反應。
案例B、C兩種情況下，無論是抗原和抗體（配體和受體）結合反應，兩者反應有生成復合物的正反應過程，也有復合物解離反應生成抗原、抗體逆反應過程，終的結果是抗原，抗體和抗原-抗體復合物三者共存的狀態。

這樣的反應稱之為可逆反應。
當一個可逆反應中正反應和逆反應的速度相等時，反應體系中抗原的濃度、抗體的濃度和抗原-抗體復合物濃度不再增加也不再減少，可逆反應完成，反應體系中各成分摩爾濃度處于動態平衡。

親和力(Affinity)是可逆反應過程中抗原、抗體和抗原-抗體復合物之間的相對狀態的特征參數，其更加專業性和術語化的名稱是解離平衡常數KD，單位mol/L(和濃度單位一致)。

親和力數值越小則親和力越強，親和力的強弱決定了終決定反應完成時可逆反應各組分相對多少。

如例子B和C同樣是和200nM CD279（PD1）反應，抗體pembrolizumab (PD1抗體)相對于CD279的親和力為0.4nM, 配體CD274（PDL1）相對于CD279的親和力為8200 nM,終反應生成的pembrolizumab-CD279復合物是97.86 nM,而CD274- CD279復合物僅僅只有2.35nM，兩者相差42倍。

有別于不可逆反應，除了抗原抗體的摩爾濃度外，抗原和抗體（配體和受體）兩者間的親和力將極大的影響可逆反應中生成物的多少。

三、你知道ELISA進行方法學開發時的基本原則嗎？

對于親和力測定方法和原理的概述，讀者可參考生物功能學篩選評價技術之親和力評價篇。
本文主要對飽和濃度法進行概括。
R代表受體或抗原，L代表配體或抗體。
采用飽和濃度法，如果要測定配體相對于受體的親和力，少量R存在的情況下，將L進行梯度稀釋，檢測R-L復合物的濃度，當R-L復合物的濃度占總R濃度的一半時，L對應的濃度值（EC50）即L相對于R的KD值。
RL復合物/R即B值可用檢測的信號值代替，梯度稀釋的L和信號之間的函數關系滿足下面的公式，只有在此在特定的實驗條件下EC50值能夠等價于KD值。
飽和濃度法測定KD值有幾個關鍵點，即相互作用的兩個分子，R要少量，L要進行連續的梯度稀釋，需要得到的信號響應值（所有的R的結合位點被L占據）即平臺期，那么在此條件下，占據一半R時，所需要的L濃度（EC50）為KD值。
飽和濃度法主要測定的是代表RL復合物的信號值，測定方法可以是流式細胞術、同位素標記術、熒光偏振，也可以是ELISA。

四、用于親和力測定的ELISA方法學開發常用方法

布局

一般操作流程

01 酶標板的制備：取濃度為100 ug/ml抗原，室溫溶解，混勻用包被液按如下步驟稀釋至0.2ug/ml，0.5ug/ml，1ug/ml，按加樣布局表加入100ul/孔，分別加入酶標板條中(Note 1)，其中加入包被液做包被抗體的對照，2-8℃過夜；
02用洗滌液洗板3次，拍干，加入300ul/孔封閉液(Note 2)室溫封閉1小時；洗滌液洗板3次，拍干待用；
03 按照布局將抗體以100000ng/ml起始3倍梯度稀釋（Note 3），按照布局，100ul/孔加入微孔板中；
04放入奧豪斯微孔板振蕩器 (ISLDMPHDG)內，設置37℃、600rpm振蕩1小時；  

05用洗滌液洗板3次，拍干；
06酶聯抗體稀釋到合適的濃度（Note 4），在奧豪斯渦旋儀（VXMNFS）上混勻，100ul/孔；

07放入微孔板振蕩器內，設置37℃、600rpm振蕩1小時；    
08用洗滌液洗板4次，拍干；
09取酶聯抗體對應的顯色液，臨用前20分鐘拿出平衡到室溫，在漩渦混合器上混勻；
10使用8道排槍以100 ul/孔加入顯色液；
11顯色液室溫避光放置10-30分鐘 （Note 5）；
12使用8道排槍以100 ul /孔加入終止液終止反應（根據底物的不同，此步驟可能不需要）；
13用酶標儀測定信號值（Note 6）；
14結果分析（Note 7）。 

貼心小NOTE

Note1：如果需要減少反應過程中高濃度的抗體（100000ng/ml）對酶標板材的非特異吸附，在包被過程中，建議選擇疏水性酶標板材（polysorp）,包被的抗原濃度需要少量0.2-1ug/ml，具體情況需要根據抗原抗體的親和力大小來進行判斷優化。一般來說親和力越強，所需的抗原包被濃度越低。
Note2：封閉液不一定能起到封閉效果，需要實驗驗證（未包被抗原的分組），一般來講分子量越小的封閉劑效果越佳。
Note3：在方法學開發的初期可以拉大一下標準曲線的濃度范圍100000ng/ml-0.1ng/ml，以得到有明顯上下平臺期的全曲線，當抗原抗體間親和力較強時，梯度濃度可縮小，稀釋的倍數可在方法學優化過程中縮小至2倍。
Note4：酶聯抗體效應過量，酶聯抗體的稀釋需要做不同的稀釋度進行比較選擇，對于單抗成分的酶聯抗體，如果高低兩個稀釋度的酶聯抗體能夠產生一樣的劑量曲線，說明酶聯抗體過量，ELISA的信號傳遞未產生偏差。
對于多抗成分的酶聯抗體，其稀釋度的判斷較為復雜，可以初略計算下酶聯抗體的摩爾濃度要高于包被上的抗原摩爾濃度的5倍以上。當酶聯抗體濃度較小時，酶聯抗體在高劑量不同濃度的抗體條件下均被抓到，曲線有假上平臺。
Note5：對于吸光度值底物和熒光底物，儀器檢測的信號值和顯色時間成正比，控制在10-30分鐘為宜。需要提前確認檢測儀器的信號線性范圍，比如一般的酶標儀吸光度值的信號線性范圍在0-3，吸光度值在3-4之間為非線性的，在顯色時應控制信號值不要超過3，當信號值超過線性范圍時，曲線有假上平臺。
Note6：不同底物需要用不同的儀器進行檢測，吸光度讀值，熒光讀值，化學發光讀值。在底物選擇過程中注意實驗室的酶標儀是否具備該種類型的讀數功能。
Note7：標準的劑量曲線擬合一般用四參數擬合，需要有明顯的上下平臺期（A，D值），斜率一般在0.8-1.2（B值）之間，EC50（C值）即為抗體相對于抗原的親和力值。

五、總結

根據飽和濃度法，采用ELISA進行親和力測定時，需要有明顯的四參數S型曲線，即需要有隨抗體濃度漸進變化的信號曲線。
在抗體低濃度和高濃度時有明顯的上下平臺期，上平期信號值的一半對應的抗體濃度（EC50）值即抗原抗體間親和力KD值。
由于儀器的檢測信號的線性范圍是有限，當信號超過線性范圍時會使曲線進入假上平臺期使得測得的親和力不準。
包被的抗原濃度直接決定了信號的信號值，所以在用ELISA進行親和力測定時，包被的抗原濃度盡量要小，以得到合適的信號值；酶聯抗體濃度過低時也可能使曲線進入假平臺期。

在ELISA方法學開發過程中，酶聯抗體過量以信號的線性傳遞需要經過實驗驗證。
當信號無法得到有效的上平臺期時，說明抗原抗體間的親和力太弱或者包被抗原過多，需要更大濃度的抗體才能使得所有抗原被抓住以達到平臺期。
受限于ELISA靈敏度的限制，在一些親和力較弱（>100nM）的抗體抗原中，采用ELISA方法基本得不到有效的平臺期，也無法測得的親和力數值。
ELISA進行親和力測定評價抗原的活性或者測定抗體活性時，得到的EC50并非越小越好，信號進入假平臺期（達到儀器的檢測極限，酶聯濃度較小）均會使EC50變小，從而得到錯誤的親和力數據，這也是ELISA進行親和力測定時容易產生的謬誤。
如今很多抗原蛋白的供應商關于抗原活性的評價均存在此類謬誤。

抗原和抗體間的親和力是有兩者的結構和相互作用決定的，可能是0.1 nM,1 nM或者1000 nM。評價ELISA親和力測定方法的好壞需要看此EC50值是否和親和力的值相符，親和力的值可通過熱力學測定方法，動力學測定方法和飽和濃度法中的細胞流式測定法等多方面驗證。
反過來說當一個ELISA方法不存在諸如信號進入假平臺期（達到儀器的檢測極限，酶聯濃度較小）等謬誤時，其EC50值才能真實的反應親和力的數值。

采用ELISA進行方法學開發需要明確應用目的，大分子定量和親和力測定。
不同的應用目的，抗原和抗體的相對劑量濃度會有很大的差異，有不同的劑量曲線，讀者可以結合上篇《ELISA方法學開發實踐版-生物大分子檢測的定量方法開發》進行對比研究，明晰差異。

本期分享就到這里啦，我們下期再會喲！

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