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一、引言

二、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1. 綿羊卵巢采集自當(dāng)?shù)赝涝讏?chǎng)，離體 2 小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，于預(yù)冷生理鹽水中保存，用于卵母細(xì)胞采集。

2. 細(xì)胞系選用綿羊成纖維細(xì)胞，由實(shí)驗(yàn)室前期分離培養(yǎng)并凍存，復(fù)蘇后傳代至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期用于實(shí)驗(yàn)。

3. 白藜蘆醇、褪黑素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自藥企，純度超 98%，以二甲基亞砜（DMSO）配制成母液，工作液現(xiàn)用現(xiàn)配，確保 DMSO 終濃度低于 0.1%，排除其干擾。

（二）實(shí)驗(yàn)分組

1. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組、白藜蘆醇低劑量組（1 μmol/L）、白藜蘆醇高劑量組（10 μmol/L）、褪黑素低劑量組（100 nmol/L）、褪黑素高劑量組（1 μmol/L）及聯(lián)合用藥組（白藜蘆醇 1 μmol/L + 褪黑素 100 nmol/L），每組設(shè) 6 個(gè)復(fù)孔。

2. 卵母細(xì)胞實(shí)驗(yàn)依相同劑量梯度分組，每組至少 30 枚卵母細(xì)胞，重復(fù) 3 次，確保樣本代表性。

（三）實(shí)驗(yàn)流程

1. 細(xì)胞處理：將綿羊成纖維細(xì)胞接種于 96 孔板，培養(yǎng) 24 小時(shí)貼壁后換液，分別加入含不同藥物濃度培養(yǎng)基，孵育特定時(shí)長(zhǎng)（24、48、72 小時(shí)），對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)細(xì)胞活性、氧化應(yīng)激指標(biāo)等。

2. 卵母細(xì)胞操作：采用機(jī)械法結(jié)合酶解法獲取卵丘 - 卵母細(xì)胞復(fù)合體，經(jīng)體外成熟培養(yǎng)體系預(yù)平衡后，加入藥物處理，培養(yǎng) 24 小時(shí)觀察成熟率，后續(xù)行孤雌激活評(píng)估早期胚胎發(fā)育潛能，記錄卵裂、囊胚形成數(shù)據(jù)。

（四）檢測(cè)指標(biāo)

1. 細(xì)胞活性以 CCK - 8 法測(cè)定，吸光度值間接反映存活細(xì)胞數(shù)量；細(xì)胞凋亡借 Annexin V - FITC/PI 雙染流式細(xì)胞術(shù)分析，精準(zhǔn)量化凋亡比例；活性氧（ROS）水平用 DCFH - DA 熒光探針標(biāo)記，熒光強(qiáng)度與 ROS 呈正相關(guān)。

2. 卵母細(xì)胞成熟依第一極體排出判定，成熟率 = 排出第一極體卵母細(xì)胞數(shù) / 總卵母細(xì)胞數(shù) ×100%；胚胎發(fā)育潛能觀察卵裂期胚胎數(shù)量及囊胚形成率，囊胚率 = 囊胚數(shù) / 卵裂胚胎數(shù) ×100%。

三、結(jié)果

（一）細(xì)胞層面

1. 細(xì)胞活性：與對(duì)照組相較，白藜蘆醇及褪黑素各劑量組處理 48 小時(shí)后顯著提升綿羊成纖維細(xì)胞活性（P < 0.05），聯(lián)合用藥組增幅尤為突出，高劑量白藜蘆醇單藥效果次之，表明二者具協(xié)同促增殖潛能。

2. 抗氧化能力：藥物處理組 ROS 水平呈劑量依賴性降低，褪黑素高劑量組 72 小時(shí)降幅達(dá) 45%，白藜蘆醇組亦有效抑制氧化應(yīng)激，聯(lián)合組 ROS 清除效率超 60%，同時(shí)抗氧化酶（SOD、CAT）活性增強(qiáng)，維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)。

3. 抗凋亡表現(xiàn)：流式結(jié)果顯示，處理組凋亡細(xì)胞比率顯著減少，白藜蘆醇通過(guò)激活 PI3K/Akt 通路抑制線粒體途徑凋亡，褪黑素則上調(diào)抗凋亡蛋白 Bcl - 2，聯(lián)合用藥近乎消除早期凋亡峰，全方面守護(hù)細(xì)胞存活。

（二）卵母細(xì)胞層面

1. 體外成熟：白藜蘆醇與褪黑素顯著加速卵母細(xì)胞成熟進(jìn)程，高劑量組成熟率較對(duì)照組提升約 18%（P < 0.05），聯(lián)合用藥使成熟時(shí)間提前約 2 小時(shí)，皮質(zhì)顆粒分布更均勻，預(yù)示受精能力增強(qiáng)。

2. 胚胎發(fā)育：經(jīng)孤雌激活，處理組卵裂率及囊胚率大幅改善，褪黑素助力早期卵裂，白藜蘆醇促進(jìn)囊胚形成及內(nèi)細(xì)胞團(tuán)增殖，聯(lián)合組囊胚發(fā)育至孵化階段比例明顯增加，胚胎質(zhì)量顯著優(yōu)化，為后續(xù)胚胎移植奠基。

四、討論

五、結(jié)論