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GFP-Nanoab-Agarose

貨號：GNA-25-500/GNA-50-1000

儲存條件：可在4℃保存1年，或在-80℃長期保存，避免反復凍融。

產品描述

偶聯anti-GFP納米抗體的瓊脂糖珠子用于免疫沉淀GFP融合蛋白。

產品優勢

沒有普通抗體的輕鏈和重鏈；

高親和力：解離常數達到pM級別；

高載量：10μl的slurry可以結合2-4μg GFP蛋白；

較短的孵育時間，結合5-30min即可；

應用范圍

可用于免疫沉淀（IP）/免疫共沉淀（CoIP）、染色質免疫沉淀（ChIP）/RNA結合蛋白免疫沉淀（RIP）、酶活性測定、質譜分析等；

特異性

可以結合GFP、EGFP、YFP和EYFP等。

產品特性

存儲緩沖液：PBS(含有20%乙醇)。

實驗步驟：

收集細胞：

每個免疫沉淀反應大約使用 106-107 個表達綠色熒光蛋白融合蛋白的細胞，可根據綠色熒光蛋白融合蛋白表達量適當調整細胞數。吸出培養基，向培養皿中加入預冷的1×PBS，漂洗2次，利用細胞刮或trypsin消化收集貼壁細胞，細胞轉移到離心管，500g離心3分鐘并丟棄上清液。

植物組織裂解處理：

取適量植物組織樣本（葉片等）放置于冷凍液氮中，之后將冷凍后得植物組織樣本放于研缽進行研磨，盡可能充分研磨破壞其細胞壁。加入500-1000ul RIPA 裂解液（需加蛋白酶抑制劑）進行裂解，為了提高裂解效率，可加入200ul 玻璃粉充分震蕩 30min，裂解完成后12000 rpm，離心30min，吸取上清置新的離心管中，棄去沉淀。

動物細胞裂解：

1．在裂解緩沖液中加入蛋白酶抑制劑，用500μl預冷的裂解緩沖液重懸細胞。

2．置于冰上30分鐘，可每10分鐘充分吹打一次。

3．4℃，20,000g離心15分鐘，將裂解產物（上清）轉移到一個新的預冷管中，丟棄沉淀。注意：此時細胞裂解產物可長期保存于-80℃。

平衡珠子：

4．振蕩充分混勻GFP-Nanoab-Agarose， 吸取20μl該產品到500 μl預冷的裂解緩沖液中，4℃，2,500g離心2分鐘，丟棄上清液。（此步驟可選）  

結合蛋白

5．將平衡好的GFP-Nanoab-Agarose加入到細胞裂解產物中（如果未做第4步，可在細胞裂解產物中直接加入20μl該產品），于4℃旋轉混合結合5-30min。如果需要，留存50μl的裂解產物進行免疫印跡分析。
6．4℃，2,500g離心2分鐘，丟棄上清液。如果需要，留存50μl上清液進行免疫印跡分析。

清洗珠子：

7．用500μl預冷的裂解緩沖液中重懸6中的GFP-Nanoab-Agarose，4℃，2,500g條件下離心2分鐘，丟棄上清液并重復洗滌2次。

洗脫蛋白：

方法一：
8．加入20μl 2×SDS-sample buffer重懸GFP-Nanoab-Agarose。95℃，加熱10min，2,500g離心2分鐘收集上清，收集的產物可進行SDS-PAGE及免疫印跡分析。

方法二：
9．替代步驟8的可選步驟：加入50μl 0.2 M pH2.5的Glycine洗脫結合的蛋白，孵育時間30秒，期間不斷混勻，2,500g離心2分鐘收集上清，為了中和酸性的Glycine，需加入5μl 1.0 M Tris（pH10.4）。注意：為了提高洗脫效率可以重復這一步。

可選方案

方案一：
如需進行GFP融合酶的活性檢測，無需洗脫，可以直接檢測。
方案二：
如需進行染色質免疫沉淀（ChIP）實驗，主要用于含有GFP融合蛋白的蛋白質/DNA相互作用的實驗。染色質免疫沉淀一般包括細胞固定，染色質斷裂，染色質免疫沉淀，交聯反應的逆轉，DNA的純化以及DNA的鑒定。其中前期細胞固定，染色質斷裂不變；然后接著直接進入說明書的第5步，加入細胞裂解產物后，DNA-蛋白質復合物結合到GFP-Nanoab-Agarose上；
進入第6和7步，分離得到復合物；進入第10步，得到洗脫的復合物；后期交聯反應的逆轉，DNA的純化及DNA的鑒定等同于普通的ChIP實驗。RNA結合蛋白免疫沉淀（RIP）實驗步驟同上。
方案三：
GFP-Nanoab-Agarose 不僅可以用于在體內外檢測和驗證蛋白質之間的相互作用， 也可以結合質譜分析篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白。其操作步驟同免疫沉淀法，得到洗脫的復合物后，然后進行SDS–PAGE分析，用考馬斯亮藍或者銀染的方法染色后，切下未知蛋白的條帶，用質譜技術鑒定未知蛋白。