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活性氧 檢測試劑盒

產品貨號：O040

保存溫度：-20℃，避光保存一年

產品組分：

產品簡介：

活性氧檢測試劑盒（Reactive Oxygen Species Assay Kit）是一種利用熒光探針H2DCFH-DA進行活性氧檢測的試劑盒。H2DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細胞膜，進入細胞內后，可以被細胞內的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細胞膜，從而使探針很容易被裝載到細胞內。細胞內的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。檢測DCF的熒光就可以知道細胞內活性氧的水平。根據活細胞中熒光的產生，可以判斷細胞活性氧的含量和變化。用流式細胞儀或熒光顯微鏡可直接觀察，是一種經典的組織或活細胞中活性氧檢測方法。本試劑盒提供了活性氧陽性對照試劑Rosup，以便于活性氧的檢測。Rosup是一種混合物，濃度為50mg/mL。Rosup 為活性氧陽性誘導藥物，根據其熒光信號強度，可分析活性氧的真正水平。

本試劑盒本底低，靈敏度高，線性范圍寬，使用方便。本試劑盒可以測定1000個樣品1000T(96 孔板)。

注意事項：

1. 探針裝載后，一定要洗凈殘余的未進入細胞內的探針，否則會導致背景較高。

2. 陽性對照Rosup 一般使用濃度為100 μM （推薦濃度100-400μM，具體依細胞類型而定）。通常刺激后0.5-4h 可觀察到顯著的活性氧水平升高。對于不同的細胞，活性氧陽性對照的效果可能有較大的差別。如果在刺激后30min 內觀察不到活性氧的升高，可延長誘導時間或適當提高活性氧陽性對照的濃度。如果活性氧升高得過快，可縮短誘導時間或適當降低活性氧陽性對照的濃度。

3. 對于某些特別的細胞，實驗過程中如果發現沒有刺激的陰性對照細胞熒光也比較強， 可以按照1:2000-1:5000 稀釋DCFH-DA， 使DCFH-DA 的終濃度為2-5 μM。探針裝載的時間也可以根據情況在15-60 min 內適當進行調整。

4. 活性氧陽性對照(Rosup) 僅僅用于作為陽性對照的樣品，并不是在每個樣品中都需加入活性氧陽性對照。

5. 探針裝載完畢并洗凈殘余探針后，可以進行激發波長的掃描和發射波長的掃描，以確認探針的裝載情況是否良好。DCF的激發光譜和發射光譜請參考上圖。

6. 盡量縮短探針裝載后到測定所用的時間（刺激時間除外），以減少各種可能的誤差。

7. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

8. 定量的話要作標準曲線吧。先做一個不同濃度H2O2氧化DCFA熒光值，做一條標準曲線，X軸為H2O2濃度，y軸是熒光值，得出一個方程，在看你樣品的熒光值即Y值是多少，對應的X值就是。

9. 有的細胞裝載探針后細胞容易漂起來，洗細胞時實驗組會吸走一部分細胞。所以種細胞時細胞量增加一倍，這樣細胞緊密連接，貼壁比較牢，實驗組的熒光值就高了。另外的H2DCFDA很敏感，工作液濃度要低一些，1-2μM就夠啦，濃度太高容易有非特異性染色。這個探針很不穩定，一旦氧化了本底熒光值就會升高，最好工作液現用現配。

使用說明：

1. 裝載ROS 探針

1.1 原位裝載探針(僅適用于貼壁細胞)

a) 細胞準備：檢測前一天進行細胞鋪板，確保檢測時細胞數量小于5×105/ml。

b) 藥物誘導：去除細胞培養液，加入無血清培養基稀釋的藥物處理，于37℃細胞培養箱內避光孵育，實際誘導時間由藥物特性和細胞類型決定。

c) （可選）陽性對照：先用無血清培養基等稀釋陽性對照（Rosup, 100 mM）到常用工作濃度100 μM，加入細胞，37℃避光孵育0.5～4 h，以提高活性氧水平，不同細胞類型存在差異。例如：HeLa 細胞需孵育30-60 min，MRC5 人胚胎成纖維細胞則需孵育90 min。

d) ROS 探針準備：探針裝載前按照1:1000 用無血清培養液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μM。

e) ROS 探針裝載：吸除處理藥物，加入適當體積稀釋好的DCFH-DA 工作液。加入的體積需充分蓋住細胞。例如：6孔板通常不少于1000 μL，對于96 孔板通常不少于100 μL。37℃細胞培養箱內避光孵育30 min。

f) 細胞清洗：用無血清培養液洗滌細胞1～2 次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。

1.2 收集細胞后裝載探針(適用于貼壁細胞和懸浮細胞)

a) 細胞準備：按照標準方法培養細胞，必須保證檢測用細胞狀態。按照適當方法，清洗并收集足量的細胞。

b) 藥物誘導：將收集好的細胞懸浮于適量稀釋好的藥物，于37℃細胞培養箱內避光孵育，實際誘導時間由藥物特性和細胞類型決定。

c) （可選）陽性對照：先用無血清培養基稀釋陽性對照（Rosup, 100 mM）到常用工作濃度100 μM，加入細胞，37℃避光孵育0.5～4 h 以提高活性氧水平，不同細胞類型存在差異。例如：HeLa 細胞需孵育30-60 min，MRC5 人胚胎成纖維細胞則需孵育90min。

d) ROS 探針準備：探針裝載前，按照1:1000 用無血清培養液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μM。

e) 探針裝載：除去細胞內藥物，離心收集細胞，加入稀釋好的探針，使其細胞密度為1×106 ～ 2×107。

注意：細胞密度需根據后續的檢測體系，檢測方法，以及檢測總量來進行調整。例如：對于流式分析，單管檢測內細胞數目不少于104，也不可多于106。

f) 細胞清洗：用無血清細胞培養液洗滌細胞1-2 次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。

2. 熒光顯微照相操作方法

a) 對貼壁生長細胞或活組織，可直接在熒光顯微鏡下觀察；對懸浮生長細胞，取25-50 μL 細胞懸液滴到一張顯微載玻片上，再蓋上一張蓋玻片。

b) 熒光顯微鏡下，選用FITC 濾光片觀察熒光，去除背景觀察熒光的變化。

3. 流式細胞分析操作方法

a) 對貼壁生長細胞，用yi酶消化制備成單細胞懸液；對懸浮生長細胞，直接收集細胞。用0.5-1 mL PBS 重懸細胞(0.5～1 x 105/ml)。

b) 選擇流式細胞儀FL1 或BL1 通道，488nm 激發，測定530nm 的發射，細胞應可分成兩個亞群：ROS 陰性細胞僅有很低的熒光強度，ROS 陽性細胞有較強的綠色熒光。

4.參數設置

使用488nm激發波長，525nm發射波長，實時或逐時間點檢測刺激前后熒光的強弱。DCF的熒光光譜和FITC非常相似，可以用FITC的參數設置檢測DCF。DCF的激發光譜和發射光譜參考下圖。

使用活性氧檢測試劑盒(Reactive oxygen species assay kit)顯示CHO細胞內活性氧熒光。

左圖：CHO細胞用試劑盒配備的活性氧陽性對照處理；右圖：正常CHO細胞。綠色熒光表明細胞活性氧急劇增加，并能顯示其定位。