氣相色譜法
一 氣相色譜法概述
色譜法概述
色譜法是一種重要的分離分析方法，它是利用不同物質在兩相中具有不同的分配系數(或吸附系數、滲透性)，當兩相作相對運動時，這些 物質在兩相中進行多次反復分配而實現分離。在色譜技術中，流動相為氣體的叫氣相色譜，流動相為液體的叫液相色譜。固定相可以裝在柱內，也可以做成薄層。前者叫柱色譜，后者叫薄層色譜。根據色譜法原理制成的儀器叫色譜儀，目前，主要有氣相色譜儀和液相色譜儀。
色譜法的創始人是俄國的植物學家茨維特(Tswett)。1906年，他將從植物色素提取的石油醚提取液倒人一根裝有碳酸鈣吸附劑的豎直玻璃管中，然后用石油醚淋洗，結果使不同色素得到分離，在管內顯示出不同的色帶，色譜一詞也由此得名。這就是zui初的色譜法。后來，這種方法逐漸廣泛地用于無色物質的分離，但色譜一詞仍沿用至今，在50年代，色譜法有了很大的發展。1952年，詹姆斯和馬丁以氣體作為流動相分析了脂肪酸同系物并提出了塔板理論。1956年范第姆特總結了前人的經驗，提出了反映載氣流速和柱效關系的范笨姆特方程，建立了初步的色譜理論。同年，高萊(Golay)發明了毛細管拄，以后又相繼發明了各種檢測器，使色譜技術更加完善。50年代末期，出現了氣相色譜和質譜聯用的儀器，克服了氣相色譜不適于定性的缺點。近年代，由于檢測技術的提高和高壓泵的出現，液相色譜迅遠發展，使得色譜法的應用范圍大大擴展。目前，由于能的色譜往、高靈敏的檢測器及微處理機的使用，使得色譜法已成為一種分析速度快、靈敏度高、應用范圍廣的分析儀器。
色譜法是一種分離分析技術,經色譜柱分離后,組分要借用其他檢測手段一一檢測，色譜法的本質在于色譜柱高選擇性的分離作用和高靈敏度檢測技術的結合。混合組份的樣品在色譜柱中的分離依據是：同一時刻進入色譜柱的各組份，由于在流動相和固定相之間溶解、吸附、滲透或離子交換的不同，隨流動相在色譜柱中運行時，在兩相之間進行反復多次（103—106）的分配過程，使得原來分配系數具有微小差別的各組份，產生了保留能力明顯差異的效果，進而各組份在色譜柱中的移動速度就不同，經過一定長度的色譜柱后，彼此分離開來，zui后按順序流出色譜柱而進入檢測器，在色譜數據處理機或工作站上顯示出各組份的色譜行為和譜峰數值。基于上述原理建立的分析方法稱為色譜法。氣相色譜法是流動相為氣體的一類色譜分析法。
二 氣相色譜方法開發
方法開發的一般步驟
就GC而言，就是首先確定樣品預處理方法，然后優化分離條件。直到達到滿意的分離結果。zui后建立數據處理的方法，包括定性鑒定和定量測定。當然這一方法要真正成為實用方法，還要進行驗證。下面是方法開發的一般步驟。
1) 樣品來源及其預處理方法
GC直接分析的樣品必須是氣體或液體，固體樣品在分析前應當溶解在適當的溶劑中，而且要保證樣品中不含GC不能分析的組份（如無機鹽）或可能會損壞色譜柱的組份。
這樣，我們在接到一個未知樣品時，就必須了解它的來源，估計可能含有的組分，以及樣品的沸點范圍。如能確定直接進樣分析，只要找一種合適的溶劑，如丙酮，己烷、氯仿，苯等就是GC常用的溶劑。一般講，溶劑應具有較低沸點，從而使其容易與樣品分離。盡可能避免用水，二氯甲烷和甲醇作溶劑，它們對延長色譜柱的使用壽命不利。如果用毛細管分析，應注意樣品濃度不要太高，以免造成柱超載，通常樣品的濃度為mg/ml級或更低。
如果樣品中有不能用GC直接分析的組分，或樣品濃度太低，就必須進行必要的預處理，包括采用一些預分離手段，如各種萃取技術，濃縮方法，提純方法等。
2) 確定儀器配置
所謂儀器配置就是用于分析樣品的方法采用什么進樣裝置，什么載氣，什么色譜柱及其什么檢測器。比如，要用GC分析啤酒的揮發性成分，就需要一個頂空進樣器，要測定水中痕量含氯農藥的殘留量，就要用電子俘獲檢測器。就色譜柱而言，常用的固定相有非極性的OV—1（SE—30）弱極性的SE—54，極性OV—17和PEG—20M等，可根據極性相似相容原理來選用，即分離一般脂肪烴類（如柴油或汽油）時多用OV—1（SE—30）。分析醇類和酯類（如含酒*料）多用PEG—20M，分析農藥殘留量則多用OV—17或OV—1701而要分析特殊的樣品，如手性異構體，就需要特殊的色譜柱，對于很復雜的混合物，SE—54往往是首先的固定相。
3) 確定安初始操作條件
初始分離條件，主要包括進樣量，進樣器溫度，檢測器溫度，色譜柱溫度和載氣流速度。
1. 進樣量要根據樣品濃度，色譜柱容量和檢測器靈敏度來確定。
2. 進樣口溫度主要有樣品的沸點范圍決定，還要考慮色譜柱的使用溫度。首先要保證待測樣品全部汽化，其次要保證汽化的樣品組分能夠全部流出色譜柱，而不會在柱中冷凝。
原則上進樣口溫度一般要接近樣品中沸點zui高的組分的沸點，但要低于易分解組分的分解溫度，常用條件為250℃—350℃。
實際操作中，只保證樣品*汽化即可而不必進行很的優化。
3. 色譜柱溫度的確定主要由樣品的復雜程度和汽化溫度決定。
原則上既要保證待測物的*分離，又要保證所有組分能流出色譜柱，且分析時間越短越好。組成簡單的樣品用恒溫分析，這樣分析周期會短一些。對于組成復雜的樣品，常需要用程序開溫分離，因為在恒溫條件下，如果柱溫較低，則低沸點組合分離得好，而高沸點組分的流出時間會太長，造成峰展寬，甚至滯留在柱中造成柱污染，反之柱溫太高，低沸點組分又難以分離。
實際上，毛細柱的zui大優點就是可以在較寬的溫度范圍內操作。這樣既保證了待測組分的良好分離，又能實現盡可能短的分析時間。
一般地講，色譜柱的初始溫度應接近樣品中zui輕組分的沸點，而zui終溫度則則取決于zui重組分的沸點。升溫速率則要依樣品的復雜程度決定，在具體工作中操作條件的選擇一定要根據樣品的實際分離情況來優化設定。
4. 檢測器溫度是指檢測器加熱塊溫度而不是實際檢測點，如火焰的溫度。
檢測器溫度設置原則是保證流出色譜柱的組分不會冷凝，同是又滿足檢測器靈敏度的要求。大部分檢測器的靈敏度受溫度影響不大，故檢測器溫度可參照色譜柱的zui高溫度設定。
5. 載氣流速的確定相對容易一些，開始可按照比*流速（氮氣約20cm/S、氦氣約25cm/S、氫氣約為30cm/S）高10%來設定，然后根據分離情況進行調節，原則是既保證待測物的*分離，又要保證盡可能短的分析時間，用填充柱時載氣流速一般設為30ml/min。
當儀器沒有配置電子氣路（EPC）控制時，必須通過皂膜流量計或測定時間的方法來測定載氣流速，通過調節柱前壓的方式來改變載氣流速，色譜柱越長，內徑越小柱溫越高，需要柱前壓越高。
當所用檢測器需要燃燒氣和輔助氣時，還要設定這些氣體的流量。
如FID檢測器，可設定為：空氣300—400ml/min、氫氣30—40ml/min
用毛細柱時：
尾吹氣（氮氣）可設為30—40ml/min
4) 分離條件優化
分離條件的優化是一個很大的題目，這里只從實用角度簡單介紹優化方法。這里只強調操作條件柱溫和載汽流速的優化。
事實上，當樣品和儀器配置確定后，一個色譜技術人員zui經常的工作除了更換色譜柱處就是要改變色譜柱溫度和載氣流速以期達到*化的分離。柱溫對分離結果的影響要比載氣的影響大。
條件優化的目的就是在zui短的分析時間內達到符合要求的分離結果。所以在初始條件下樣品中難分離物質對的分離度R大于1.5時。可來用增大載氣流速，提高柱溫或開溫速率的措施來縮短分析時間，反之亦然。
比較難的問題是確定色譜圖上的峰是否單一組分的峰。可用標準樣品對照，如果某一目的峰是兩個或以上組分的共流出峰，優化分離的任務就比較艱巨了，在改變柱溫和載氣流速也達不到基線分離的目的時就應更換更長的色譜柱，甚至更換不同固定相色譜柱，因為在GC中，色譜柱是分離成敗的關鍵。
5) 定性鑒定
所謂定性，就是確定色譜峰的歸屬，對于簡單樣品，可根據準物質對照用保留值來確定色譜圖上的峰哪個是要分析的峰。
定性時必須注意，在同一色譜柱上，不同化合物可能有相同的保留值，所以對未知物的定性僅僅用一個保留數據是不夠的，雙柱或多柱保留數值定性是GC中較為可靠的方法，因為不同化合物在不同色譜柱上具有相同保留值的幾率要小的多。
6) 定量分析
在這一步驟中是要確定用什么定量方法來測定待測組分的含量。
常用方法有：峰面積（峰高）百分法，歸一化法、內標法、外標法和標準加入法（疊加法）。峰面積（峰高）百分比法zui簡單也zui不準確，只做精略定量。
不同化合物在同一條件下，同一檢測器上的響應因子往往不同，故須用標準樣品測定響應因子進行校正后，方可得到準確的定量結果，故其他幾種方法均需校正。歸一化法較為復雜，它要求樣品中所有組分均出峰且要求所有組分的標準品才能定量，故很少采用。外標法是采用zui頻繁的方法，只要用一系列濃度的標準樣品作出工作曲線（樣品量或濃度對峰面積或峰高作圖）就可在*一致的條件下對求知樣品進行定量分析，只要待測組分出峰且分離*即可，而不考慮其他組分是否出峰和分離安全，但是外標法定量，分析條件必須重現，特別是進樣量。
相比而言，內標法定量精度zui高，因為它是相對于標準物（叫內標物）的響應值來定量的。而內標物要分別加入到標準樣品和求知樣品中，這樣可抵消由于操作條件（包括進樣量）的波動帶來的誤差，與外標法類似，內標法只要求待測組分出峰或*分離即可，其余組分則可用快速升高柱溫使其流出或用反吹法將其放空，這樣就可達到縮短分析時間的目的。理想內標物的保留時間和響應因子應該與待測物盡可能接近，且要*分離，內標定量時，樣品制備過程要多一個定量加入內標物的步驟，標準樣品和未知樣品均要加入一定量的內標物，因此，只要定量精度要求不高，應避免使用內標法。
至于標準加入法，是在未知樣品中定量加入待測物的標準品然后根據峰面積（或峰高）的增加量來進行定量計算，其制備過程與內標法類似，但計算原理則*來自外標法。度介于兩者之間。
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