揭秘各種主流二代測序儀，無瓜攻略

隨著基因領域研究的不斷深入，自sanger測序實現對堿基信息的可讀取后，更高通量的需求使得二代測序在基因組測序、臨床檢測和生物制藥等領域展現出的潛力。

對于剛入行的小伙伴，面對各式各樣的測試平臺好奇又迷茫，Roche454、Illumina、Thermo Fisher，以及國產MGI平臺等，這么多測序儀，他們的特點是什么？背后的發展歷程是怎樣的？

今天小翊借花獻佛，梳理了目前主流的二代測序平臺，讓我們了解二代測序這十幾年的發展歷程。

表1二代測序部分儀器展示

備注：圖片來源于各儀器品牌關網和網絡

羅氏454 GS測序系統——昔日的輝煌

二代測序于2005年初登舞臺，454公司基于焦磷酸測序法推出了Genome Sequencer 20 System(GS 20)系統，開啟了邊合成邊測序（sequencing-by-synthesis）高通量測序的進程。2007年，羅氏公司收購了454，并推出了一系列性能更優的NGS系統，極大的提升測序通量和準確性，也進一步增加了測序讀長。雖然羅氏454具有讀長優勢，但是測序通量和成本始終限制了454平臺的推廣，因此羅氏在2016年底終止了454 NGS測序相關的業務。

表2羅氏454 GS測序儀器參數對比

備注：數據來源于羅氏關網和網絡

二、Illumina測序儀——測序界的巨鱷

2006年，Solexa公司推出了Genome Analyzer系統（簡稱GA），其包括DNA簇（DNA cluster）、橋式PCR（Bridge PCR）和可逆阻斷（Reversible terminator）等核心技術，這使得GA系統在高通量、低成本、應用范圍廣等方面具有明顯優點。2007年，Illumina公司收購了Solexa，并在隨后幾年間發布了多種測序儀，主要包括兩類：低通量的桌面式測序儀和高通量臺式測序儀，基本覆蓋行業內的各種測序應用，目前占據的測序*超8成。

1、Illumina HiSeq系列

  HiSeq系列由Illumina公司2010年推出，該系列非常適合全基因組、轉錄組測序。2014年1月，Illumina宣布推出HiSeq X Ten測序平臺，適用于大規模人群分析，包括10個可平行測序的超高通量測序儀，此系統號稱為第-個將人類全基因組測序成本降至1000美元或更低的測序平臺。

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測序原理：利用可逆性末端邊合成邊測序技術、四通道成像技術，每輪測序反應中存在4種核苷酸。

儀器特點：該系列儀器成本低，靈活性高，通量大。缺點是讀長短和對每個測序反應產生的大量數據的存儲和分析系統不足。

應用領域：Hiseq2500適合大規模基因組學，Hiseq3000/4000適合生產級模板的基因組學，Hiseq X Five適合生產級規模的人類全基因組測序，Hiseq X Ten適合群體規模的測序。總體來說，Hiseq系列適合全基因組測序、靶向重測序、全轉錄組測序、de novo測序、表觀遺傳調控等。

2、Illumina MiSeq

    MiSeq系列由Illumina公司2011年推出，與Hiseq分享主要的核心技術，但是體積和通量更小、價格低，Miseq更佳便于擴增子和細菌樣本測序，更佳適合臨床使用。

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測序原理：可逆性末端邊合成邊測序技術、四通道成像技術。

儀器特點：易于操作，體積小巧，可進行雙向擴增子測序，樣本制備簡易，具有2x300 bp的讀長，實現高達15 Gb的產出。缺點是不適合WGS和WES測序。

應用領域：MiSeq系列快速簡約，適合小型全基因組測序（微生物、病毒）、靶向基因測序（擴增子、基因集合）、16S宏基因組測序、靶向基因表達譜、長片段擴增子測序、DNA-蛋白互作分析及miRNA和小RNA分析等。

3、Illumina Nextseq 500

Nextseq 500是Illumina公司于2014年推出的一款高通量臺式測序儀，其大小與Miseq相當，性能卻與Hiseq相當。

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測序原理：改良型邊合成邊測序（兩通道SBS）化學原理。

儀器特點：運行時間短、測序質量高，全基因組、外顯子和RNA測序可在一個平臺完成，改良型技術效率更高。

應用領域：適合大型全基因組測序（人類、植物、動物）、小型全基因組測序（微生物、病毒）、外顯子組測序、靶向基因測序（擴增子、基因集合）、全轉錄組測序、基因表達譜（mRNA-Seq）、miRNA和小RNA分析、DNA-蛋白互作分析、甲基化測序和16S宏基因組測序。

4、Illumina MiniSeq

MiniSeq 是Illumina公司于2016年1月發布的一款小型桌面式測序儀，體積比Miseq儀器小44%。

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測序原理：可逆性末端邊合成邊測序技術、雙通道成像技術。

儀器特點：運行時間短、選擇靈活，測序質量更高。缺點是不適合WGS和WES測序。

應用領域：適合大型全基因組測序（人類、植物、動物）、小型全基因組測序（微生物、病毒）、外顯子組測序、靶向基因測序（擴增子、基因集合）、全轉錄組測序、基因表達譜（mRNA-Seq）、miRNA和小RNA分析、DNA-蛋白互作分析、甲基化測序和16S宏基因組測序。

5、Illumina NovaSeq系列

NovaSeq系列是Illumina公司于2017年1月發布的可擴展的高通量測序儀，該系列有5000和6000兩種系統，并且具有可選擇的不同數量流動槽芯片的測序模式。

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測序原理：可逆性末端邊合成邊測序技術、整合了圖案化流動槽技術。

儀器特點：可擴展、通量高、選擇靈活、簇密度和產出更高。

應用領域：使用范圍廣，以上4種類型儀器的測序領域均可覆蓋。

Illumian公司系列測序儀參數對比如表3所示：

表3 Illumina測序儀器參數對比

備注：數據來源于Illumina關網

三、Thermo Fisher體系測序儀——測序的聯合王國

2008年ABI與Invitrogen合并成為Life technologies公司，2010年8月，Life Technologies將Ion Torrent收購，2013年，Life Technologies被Thermo Fisher收購，借此Thermo Fisher正式入駐測序行業，旗下測序體系包括ABI SOLID和Ion-Proton兩種平臺。

1、ABI SOLID

ABI在收購了Agencourt Personal Genomics測序公司后，推出了SOLiD™ 5500和SOLiD™ 5500xl新一代測序儀，為廣大科研工作者提供更為全面的NGS服務解決方案。

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測序原理：微乳滴PCR與微球相結合的策略來擴增DNA模板，并在測序過程中對堿基間隔反復的讀取，拼接合成后終獲得整條模板片段的完整序列信息。

儀器特點：測序通量已達到45Gb/天，準確率高達99.99%。并且SOLiD系統對于高GC含量的樣本，也具有非常大的優勢。缺點是讀長較短，測序時間長。

應用領域：全基因組測序、染色質免疫共沉淀（ChIP）、微生物測序、數字核型分析、臨床測序、基因型分析、基因表達分析和小分子RNA的發現等等。

2、Ion PGM

Life Technologies公司于2010年推出了半導體個人化操作基因組測序儀Ion PGM™，主要用于小基因組和外顯子的測序。

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測序原理：基于離子半導體測序技術，檢測堿基摻入過程中釋放氫離子，不用熒光、化學發光和酶級聯反應，通過高敏的離子傳感器獲得信號數據。

儀器特點：樣本消耗少，準確性達到99.97%，提供3種芯片測序，流程簡單。缺點是讀長短，不利于基因組de nova組裝，并且對于單堿基重復序列準確率不高。

應用領域：小基因組測序（如微生物和病毒的從頭測序和重測序，線粒體測序等）、擴增子重測序（16S宏基因組測序）、靶基因組測序、基因組/全外顯子驗證等。

3、Ion Proton

Life Technologies公司于2012年宣布在中國推出新的臺式基因測序儀Ion Proton system，旨在一天內完成人類基因組測序。Ion Proton™測序儀采用了新一代半導體測序技術，且芯片密度比Ion PGM™測序儀高1000倍，運行速度更快，單位時間的通量更高。

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測序原理：離子半導體測序技術。

儀器特點：測序時長更短，兩種通量芯片可供選擇，單次可產生10-15Gb數據量，支持條形碼讀取并完成單片96個樣本的測序。缺點是原始數據準確性相對不高，讀長較多，平均大讀長為200bp。

應用領域：適用于外顯子（構成蛋白質的基因片段）測序，以及人類或植物基因組圖譜繪制等大型測序工程。

4、Ion S5/S5xl

2015年10月推出了Ion S5和IonS5 xl，適用于靶向測序。該系統將多個gene panel和小的基因組集合起來，并簡化操作流程和動手在操作時間，目前支持4種不同的芯片類型。

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測序原理：離子半導體測序技術。

儀器特點：運行速度更快，需要樣本少，不同通量的芯片可選。缺點是讀長較短，數據分析工具和途徑較少。

應用領域：可應用于癌癥、遺傳病、液體活檢、感染性疾病領域。使用于靶向RNA和DNA測序，微生物、轉錄組、外顯子組和RNA-seq。

Thermo Fisher體系測序儀參數對比如表4所示：

表4 Thermo Fisher體系測序儀器參數對比

備注：數據來源于Thermo Fisher關網和網絡

四、華大智造測序儀——測序屆的新貴

2013年3月18日，華大基因對CG(Complete Genomics)公司全額收購，開啟了華大測序儀之路。歷經兩年的研發和改進，華大基因推出了BGISEQ-500桌面化測序系統。之后又推出的BGISEQ-50、MGISEQ-200和MGISEQ-2000均取得了CFDA認證，還推出了MGISEQ-T7，華大測序體系得到了從8G到6T通量的覆蓋，應用領域也得到了極大的拓展。

1、Revolocity

2015年6月推出了一款*集成式的“超級測序儀”——Revolocity測序儀，該系統一年可完成10000-30000個全基因組測序，也支持全外顯子測序。

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測序原理：cPAL技術。

儀器特點：適用于大規模WGS和WES，50ⅹ深度基因組測序僅需8天，50ⅹ深度下對人類基因組測序拷貝數變異和結構變異為96%，模塊化處理全血和唾液用時少。缺點是目前于人類全基因組測序。

應用領域：全基因組測序和全外顯子測序。

2、BGISEQ-500

2015年華大基因推出了新型桌面化測序系統BGISEQ-500。

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測序原理：以cPAL技術和改進的DNA納米球技術為核心技術。

儀器特點：85%以上的數據高于Q30標準，多讀長選擇，雙芯片平臺，全自動文庫制備系統和全自動樣本加載系統，目前應用于中國大陸地區。

應用領域：NIPT、PGS、PM-Seq、染色體異常檢測、WGS、WES、RNA-seq（定量）、轉錄組測序、ChIP-Seq、small RNA等。

華大智造測序儀參數對比如表5所示：

表5 華大智造測序儀器參數對比

五、小結

羅氏454則在長讀長、低通量和高精度需求領域還有少許應用。雖然羅氏454在二代測序儀名落孫山，但是并未放棄，其在臨床檢測領域也做出了許多的努力。

華大測序儀作為后起新秀，在不斷布局，覆蓋各種通量和測序領域，由于其成本相對較低，并且具有本土優勢，市場較為看好。如果能夠在敏感性與特異性之間做到平衡優化就更好了。

Thermo Fisher旗下的多種測序儀雖然市場占有相對較小，但是其主要服務的臨床檢測行業的市場前景還是非常向好的。如果能解決Ion Torrent平臺的傳感器在測量同一堿基連續出現時所產生的誤差也勢必會吸引更多的客戶。

總體而言，目前市場的占有還是Illumina公司，其測序平臺之間具有高度互補性與交叉性，使得其在短讀長測序上大占優勢，但是在讀取那些高AT或高GC富集的片段的時候錯誤率差強人意。并且隨著臨床診斷的興起，Illumina也面臨著巨大的挑戰。

六、測序儀選擇

以上，小翊給大家介紹了二代測序儀的基本情況，那怎么樣才能選擇一款合適的測序儀呢？其實二代測序儀選擇主要基于儀器性能指標和臨床需要。總體來說，臨床實驗室需要多種用途、性能穩定、性價比高和具有便于操作者試用的生物信息學工具的測序儀。可以綜合考慮以下幾個方面進行選擇：

參考文獻：李金明，高通量測序技術，2018，科學出版社。