四大因素，從源頭解析Duplication

導語：

測序技術面世至今發生了諸多的技術革新，經歷了sanger測序為代表的第—代測序、高通量為代表的第二代測序和單分子實時測序為代表的第三代測序。迄今為止，高通量測序（ next generation sequencing NGS）技術日趨成熟，正式進入臨床疾病診療階段，與我們生活息息相關。

Dup背景解讀

高通量測序檢驗流程可分為“實驗室操作”（又稱為“濕實驗”）和“生物信息學分析”（又稱“干實驗”）兩部分。對應的實驗操作部分，可點擊高通量建庫了解。生物信息學主要是測序完成之后的數據分析和解讀，包括數據的拆分、比對和匯總，其中數據的有效性，也就是報告中常見的duplication rate 這一名詞，是生信分析的一個重要指標，它讓我們對測序得出的數據進行一個大致的了解。

所謂Dup，即重復序列Duplicate reads（涉及相關概念可點擊此處），這些重復序列在總測序序列中占比簡稱為Dup rate。由于這些重復序列不能帶來額外信息，相反會影響變異檢測結果準確性，因此下游生信分析中這些重復序列是需要去除的去掉，這也就意味著Dup rate越高，數據利用率越低，測序成本浪費的也就越多。因此在NGS生信分析中首要了解的就是dup rate的占比

常見測序對應Dup可能值

影響Duplication Rate的因素

高通量測序技術的不斷革新，生物信息學的分析也不斷進步與發展，就dup來源，根據其定義與現實的案列分析，客觀來講主要有以下幾個方面：

1.樣本本身所導致的dup值

2.建庫過程中產生的dup值（片段化，接頭連接，PCR擴增）

3. Cluster生成對dup的影響（主要指上機之后）

4. 光學分辨引起的dup

通常來講，我們認為的dup都是些無效數據，且基本上都是從建庫過程中產生的，但實際案列告訴我們，有些時候dup也是“好”的有用數據，上機過程導致的dup值可能要要比我們建庫過程中產生的dup值要大的多。

影響因素解讀：

1樣本本身所導致的dup值

不同物種的基因含量不同，基因多樣性不同，對應的基因表達情況也千差萬別。在*相同操作的前提下，不同的樣本對應的dup值也有所差別。比如

1）cfDNA和ctDNA：游離DNA斷裂不是隨機的而是有偏向性的，自然cfDNA的分子多樣性可能會比人工cfDNA要差一些，且片段長度一般分布在165bp左右，較為集中的size分布比物理打斷的size分布更不容易丟失片段，這樣可能導致相比較常規的基因組樣本cfDNA和ctDNA引起Duplication Rate會高一些。

2）基因組DNA ：以人類基因組為列，本身含有大量的基因組信息，不同細胞相同編號染色體在基因組片段化過程中是有可能產生一些起始位置和終止位置相同的分子片段的。此時對應的dup值就是樣本本身的dup值。在后期分析中可以作為保留數據進行分析。

3）甲基化DNA：經過亞硫酸氫鹽反轉的DNA，堿基類型都少了一種，分子多樣性不但下降，更是引入了尿嘧啶，外加一些建庫方式有著明顯的GC偏好性，導致后期對應的dup值會明顯的變高。

4）RNA：一般我們所做的測序都是全外顯子組，只占全基因組的2%不到，少了內含子以及非基因區域的參與，同時對應有高表達的基因和不表達的基因，分子多樣性肯定就弱了很多。后期對應的dup值是目前測序中占比量較高的樣本。

2.建庫過程中產生的dup值

1）片段化對Duplication Rate的影響

無論是超聲波打斷、高壓氣體噴斷，還是酶切切斷，都要注意隨機性和均一性，同時需要保證片段化之后獲得適當的長度，片段長度越小，導致擴增越容易，加劇了PCR bias，后引起PCR產物復雜度降低，dup rate升高。

2）鏈接效率對Duplication Rate的影響

對末端修復連接的效率的考量應該根據樣本類型來考慮，比如ctDNA，單細胞樣本，對應的連接效率就要很高，不然低頻的目標片段就會消失。某種程度上，連接效率越高，分子多樣性越好，dup rate也就越低。

3）PCR擴增對Duplication Rate的影響

首先我們了解一下PCR bias：

PCR擴增帶有一定的偏好性和錯配率，會影響終形成文庫的覆蓋度和測序準確性。

PCR本身對于不同GC含量的樣本的擴增效率是不同的，中等GC含量擴增效率///高，高GC含量擴增慢，也就是說PCR循環越多，擴增困難和擴增容易的片段之間相差就會越大，對應的分子多樣性就會越低，dup就會增大。

另外PCR本身在擴增的過程中可能會產生一些堿基的錯配，錯誤的擴增可能會到出現與現有相同基因的結果，導致dup值升高。

另外我們解釋一下，為什么我們PCR擴增要控制在較小的循環數內。

我們知道PCR過程中，每一次循環，對應生成的產物都是一樣的，PCR放大成百上千倍，為什么NGS的Dup rate只有十位數甚至是個位數呢？（對應的數學解釋可參考對應的參考文獻1）

舉例如下：

有編號1~1,000,000,000的1億個小球不同的DNA///片段），通過某種方法復制了一下（PCR擴增），然后每個編號的小球都變成了10個?，F在，你要從里邊挑選出1萬個小球出來（測序數據量），挑選兩個一樣的概率會有多大呢？也就是說雖然PCR將待測分子放大了成百上千倍，但是相對于數量遠遠多于納米孔/點數的Unique分子來說，能在茫茫人海中被1個孔隨機選中已是萬萬幸，更何況是再次隨機選中同一個Unique分子簇中的Copy形成Dup呢？

因此對于PCR過程中的dup值，我們可以人為的增加投入樣本的量（增加樣本DNA的多樣性），同時降低PCR的循環數，選擇均一性和保真性較好的擴增酶，就可以將這一過程中產生的dup，控制在合理的范圍內。

3. Cluster生成對dup的影響

Cluster在flowcell上的生成也是一個PCR過程。這個PCR比較容易被人遺忘。如果cluster變少，影響dup rate。原因是比例少的分子可能不能產生cluster，唯—性分子數減少，進而影響dup rate。適當的cluster生成密度，不僅能夠獲得///佳的數據產量，也能夠獲得較低的dup rate。目前的平臺中，我們都希望cluster是單克隆(monoclonal)的，多克隆(Polyclonal)的cluster會出現空間距離過近而導致圖像識別時相互overlap的cluster被測序識別程序過濾掉，造成的直接影響就是cluster密度過高，數據產量降低，整張芯片的cluster多樣性降低，造成dup rate升高。

4. 光學分辨引起的dup

目前的測序平臺主要包括兩種擴增方式illumina和life的線性分子擴增，和ICG的滾環擴增，形成的DNA Nanoball都是靠流體來保證芯片表面利用率的，芯片利用率是數據高產出的基礎，相反待測分子與芯片的結合的同時，可能導致反應不充分的信號點因為信號強度顯著弱于反應充分的“鄰居”，從而被映射成兩個孔表達出一樣的信號，也就是一種光學上的Dup。

總結：

綜合考慮分析，影響dup的主要因素就是DNA的多樣性，其中樣本本身所產生或者增加的dup值，這種情況占比量較小，我們一般可以忽略；PCR產生的dup值，我們在選擇均一性和保真性較好的擴增酶的同時，人為的降到底拷貝數也是可行的（一般控制在6-10 cycle）；至于Cluster和光學分辨引起的dup，主要是和測序平臺相關，不同測序平臺還是有一定的差異的，主要原因是cluster與光學分辨過程中導致的DNA多樣性的改變和信號收集的誤差，目前來說可能是產生dup的主要來源。

【1】Eric Vallabh Minikel. How PCR duplicates arise in next-generation sequencing[Z].2012,12.

【2】illumina. Effects of Patterned and Nonpatterned Flow Cells [Z]. 

【3】 Sayols S, Scherzinger D, Klein H. dupRadar: a Bioconductor package for the assessment of PCR artifacts in RNA-Seq data. BMC Bioinformatics. 2016 Oct 21;17(1):428

【4】Natarajan KN, Miao Z, Jiang M，et al. Comparative analysis of sequencing technologies for single-cell transcriptomics. Genome Biology. 2019 Apr 9;20(1):70.