鏡質合璧  還原真實

質譜成像應用于酶組織化學分析

摘要

檢測酶促反應通常通過底物和酶反應后的產物繼續反應顯色并測量吸光度來實現。現有的酶促反應檢測方法既要求底物和酶之間的初級反應，又要求隨后產生顏色的二級反應。一種新的酶促反應檢測方法利用質譜技術無需進行二級反應即可直接檢測初級反應產物。將這種方法用于組織表面分析，還可以對酶活性進行可視化分析。本文描述了使用高空間分辨率質譜成像系統iMScope進行酶組織化學分析的新應用。

引言

酶在組織中的分布通常用免疫組織化學（IHC）方法來測定。雖然IHC能夠可視化表征酶蛋白的位置，但無法區分活性酶和非活性酶。酶組織化學作為一種成熟的方法，能夠可視化分析酶活性，這是無法通過IHC分析實現的1)，2) 。酶組織化學依賴組織切片表面上發生的酶活性化學反應，以此識別酶活性及其強度。可視化分析通常將反應底物涂敷到組織切片，組織切片與內源酶發生反應，產物繼續通過另一種反應顯色。采用這種方法，每種顯色反應對應一種化合物，因此，多化合物可視化分析需要進行多種顯色反應。使用這種方法來可視化分析酶活性的分布通常并非是一種簡單的將底物添加到組織切片的過程。作為替代常規酶組織化學顯色反應步驟的一種方法，本研究考察了利用成像質譜（MSI）直接檢測小鼠腦切片和整個果蠅切片中酶促反應產物的方法3) 。

實驗

本研究試圖對野生型小鼠腦切片和整個野生型果蠅切片中乙酰膽堿酯酶（AChE）活性的分布進行可視化分析。AChE能夠催化底物乙酰膽堿分解為膽堿和乙酸。因此，本研究將乙酰膽堿涂敷到組織樣本的表面，并檢測其降解產物膽堿并評價酶活性。為與內源性膽堿進行區分，將氘標記的乙酰膽堿-d9（ACh-d9）作為底物，并檢測膽堿-d9（Choline-d9）（圖1）。利用噴槍將底物手動涂敷至組織切片表面。

圖1 MSI法酶組織化學原理

將標記后的底物涂敷于樣本表面，利用質譜檢測酶促反應產物，并進行可視化分析。

本研究同時考察了進行半定量分析的反應時間和方法。

將α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-CHCA，Sigma-Aldrich）作為基質，通過兩步法4) 進行基質涂敷，該方法結合了基于iMLayer基質升華儀（圖2）的升華法和手動涂敷α-CHCA溶液的噴霧法。

使用iMScope成像質譜顯微鏡（圖3）進行MSI檢測，并使用IMAGEREVEA MS質譜成像分析軟件進行數據分析（圖4）。iMScope實驗參數如表1所示。

圖4 IMAGEREVEA MS質譜成像數據分析軟件

表1 MSI分析參數

結果與討論

圖 5：轉化率公式和酶活性公式

圖6

(A)  樣本組織表面底物轉化比例與酶反應時間關系

以底物涂敷時間為0分鐘，結果顯示所有乙酰膽堿-d9（底物）在5分鐘內轉化為膽堿-d9。

(B)  乙酰膽堿酯酶活性在小鼠腦組織中比較

MSI結合HE染色分析結果顯示，酶活性在紋狀體（CPu）、海馬體（HP）和下丘腦（TH）中較高，而在胼胝體（CC）和小腦皮質（CBX）中較低。

(C, D) HE染色和高空間分辨率成像分析小鼠海馬體酶活性

顯示CA3區中酶活性較高。標尺：1mm

根據圖5(1)中的公式計算底物轉化率并繪制轉化率與反應時間的關系圖表明，乙酰膽堿-d9在涂敷于樣品表面后迅速開始分解為膽堿-d9，并且在5分鐘內轉化停止并耗盡乙酰膽堿-d9（圖6A）。因此，5分鐘是用以測量酶活性的足夠的反應時間。由于組織定位相關的生物基質效應會給半定量分析帶來影響，圖5(2)中的公式被認為是一種標準化方法用以校正乙酰膽堿-d9和膽堿-d9的離子化效率。

使用IMAGEREVEAL MS質譜成像數據分析軟件提取m/z 155.17乙酰膽堿-d9和m/z 113.16膽堿-d9的質譜圖像。利用IMAGEREVEAL MS中提供的四則運算方法，根據公式（2）計算膽堿酯酶活性分布的圖像（圖6B和圖6D）。這些圖像顯示紋狀體（CPu）、海馬（HP）和下丘腦（TH）的AChE活性較高，而胼胝體（CC）和小腦皮質（CBX）的AChE活性較低（圖6B）。

這些結果與傳統酶組織化學方法高度匹配，證明該技術的可靠性。iMScope的高空間分辨率質譜成像還用于可視化分析大腦海馬區的酶活性（圖6C、6D）。

由于哺乳動物除AChE外還產生丁酰膽堿酯酶（BuChE），因此嘗試對不同膽堿酯酶的活性分布進行可視化研究。BuChE將乙酰膽堿和各種其他膽堿酯轉化為膽堿。將底物乙酰膽堿與四異丙基焦磷酸酰胺（iso-OMPA，一種BuChE抑制劑）一起涂敷于樣品表面，利用MSI觀察AChE活性的特異性分布。針對BuChE活性的特異性分布，也通過在一系列組織切片涂敷底物乙酰膽堿和AChE活性抑制劑加蘭他敏（galantamine）進行研究。這些實驗表明，在不含任何抑制劑樣本的胼胝體(CC)中酶活性，在很大程度上被iso-OMPA抑制，這表明胼胝體中的大部分膽堿酯酶活性是由BuChE引起的（圖7A）。

圖7

使用抑制劑后在小鼠腦切片中可視化觀察酶活性，以及整個果蠅切片中膽堿酯酶活性分布的MSI

(A)  使用抑制劑后可視化觀察酶活性

Iso-OMPA抑制丁酰膽堿酯酶活性實現特異性檢測乙酰膽堿酯酶活性

加蘭他敏抑制乙酰膽堿酯酶活性實現特異性檢測丁酰膽堿酯酶活性

(B)  果蠅中膽堿酯酶活性的分布

盡管果蠅屬于不同的門類，但該方法同樣適用，并揭示了大腦和胸腹區的酶活性。

尤其是在胸腹區，檢測到了可溶性酶活性，表明該方法可提供常規酶組織化學難以獲得的結果。

因此，將標記穩定同位素的底物與抑制劑一同涂敷于組織樣本表面是一種更精確的酶組織化學研究方法。

本方法甚至可以用于果蠅（一種不同門的動物）的研究。如圖7B所示，ChE活性在整個果蠅中分布不均勻，在大腦中ChE活性*，在胸腹區ChE活性也較高。果蠅頭部具有*酶活性的結果與先前報告一致5)，表明活性來自中樞神經系統中頭神經節的膽堿能神經中的AChE。相比之下，胸腹區的ChE活性很可能不是由中樞神經系統中的AChE引起的。報告顯示除中樞神經系統外，血液淋巴中也存在AChE6)，并且Zador等人觀察到可溶性AchE的存在，其結構與神經系統中的膜結合AChE不同7)。胸腹區的AChE活性與以往報告一致，證明本方法可有效進行ChE活性定位的研究。

結論

本文描述了一種基于MSI進行酶組織化學的新方法，結果顯示MSI無需顯色反應即可獲得酶活性的半定量分布結果。該方法同時還被用于果蠅切片分析，可有效可視化分析膜結合AChE和可溶性AChE的活性。尤其是可溶性酶活性的分布難以通過傳統方法獲得，這顯示了本方法的*性。對于其他酶（不僅包括水解酶，還包括轉移酶），我們還將開發更多的可視化分析方法。

致謝

誠摯感謝京都工業大學應用生物科學系染色體工程實驗室的Masamitsu Yamaguchi教授提供果蠅樣本。

<參考文獻>

1.Takamatsu, H. Histochemische Untersuchungen der Phosphatase und deren Verteilung in verschiedenen Organen und Geweben. Trans. Soc. Path. Japan 29, 429 (1939)

2.Gomori, G. Microtechnical demonstration of phosphatase in tissue sections. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine 42, 23 (1939)

3.Takeo E, Fukusaki E, Shimma S. A mass spectrometric enzyme histochemistry method developed for visualizing in situ cholinesterase activity in Mus musculus and Drosophila melanogaster. Anal. Chem. 92, 12379 (2020)

4.Shimma S, Takashima Y, Hashimoto J, Yonemori K, Tamura K, Hamada A. Alternative two-step matrix application method for imaging mass spectrometry to avoid tissue shrinkage and improve ionization efficiency. J Mass Spectrom. 48, 1285 (2013)

5.Toutant, J. P., Insect acetylcholinesterase: catalytic properties, tissue distribution and molecular forms. Prog Neurobiol. 32, 423 (1989)

6.Chadwick, L. E., Actions on Insects and Other Invertebrates. In Cholinesterases and Anticholinesterase Agents, Koelle, G. B., Ed. Springer Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg, 1963; pp 741-798.

7.Zador, E., Tissue specific expression of the acetylcholinesterase gene in Drosophila melanogaster. Mol Gen Genet. 218, 487 (1989)

文獻題目

《質譜成像應用于酶組織化學分析》

使用儀器

島津iMScope TRIO

作者

Shuichi Shimma^1,2,3；Emi Takeo1；Kaoru Nakagawa；Takushi Yamamoto；Eiichiro Fukusaki^1,2,3

1 大阪大學工學研究生院生物技術系

2 大阪大學Shimadzu Omics 創新研究實驗室

3 大阪大學開放與跨學科研究倡議研究所