離子結(jié)合型果膠(ISP)含量試劑盒操作步驟

                                分光光度法 50管/24樣

注   意 ：正式測定前取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

果膠是構(gòu)成細胞初生壁和中膠層的主要成分，主要由原果膠、果膠酸甲酯和果膠酸組成。果膠中含有半乳糖醛酸、乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸等，是許多高等植物細胞壁中含量豐富的多糖成分，其*的物理、化學(xué)性質(zhì)影響著植物源食品的口感和品質(zhì)。果膠間以Ca2+橋及其他離子鍵、氫鍵、糖苷鍵、酯鍵和苯環(huán)偶聯(lián)的方式交聯(lián)，通過不同的抽提方法可以提取各種形式的果膠，如水溶性果膠（WSP）、離子結(jié)合型果膠（ISP）和共價結(jié)合果膠（CSP）。

測定原理：

利用帶有螯合劑的酸溶液提取離子結(jié)合型果膠（ISP），采用咔唑比色法測定果膠含量。果膠水解成半乳糖醛酸，在硫酸溶液中與咔唑試劑進行縮合反應(yīng)，生成物質(zhì)在530 nm處有最大吸收峰。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、80％乙醇、丙酮、濃硫酸（不允許快遞）、研缽和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

試劑一：液體50mL× 1瓶，4℃保存。

試劑二：液體50mL× 1瓶，4℃保存。

試劑三：標(biāo)準(zhǔn)液1mL× 1支，4℃保存。

試劑四：液體5 mL× 1瓶，4℃保存；

離子結(jié)合型果膠(ISP)含量試劑盒操作步驟樣品的前處理：

1、 細胞壁的提取：取約0.3g樣本，加入1mL 80％乙醇，室溫快速勻漿，95℃水浴20min，冷卻至室溫，4000g 25℃離心10min，棄上清。沉淀加入1.5mL80％乙醇和丙酮各洗一遍（渦旋振蕩2min左右，4000g 25℃離心10min，棄上清即可），沉淀即為粗細胞壁，加入1mL試劑一（去除淀粉）浸泡15小時，4000g 25℃離心10min，棄上清，將沉淀干燥，稱重得細胞壁物質(zhì)（CWM）。

2、 ISP的提取：稱取烘干的CWM 3mg，加入1mL試劑二，充分勻漿(若烘干物質(zhì)質(zhì)地堅硬，可先研碎后再加入1mL試劑二勻漿，或者用勻漿器勻漿)。8000g 4℃離心10min，取上清液待測。

測定步驟：

1、分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至530nm處，蒸餾水調(diào)零；試劑三和試劑四37℃預(yù)熱10min以上；

2、操作表：

 混勻  

混勻95℃水浴5min后，530nm處讀取吸光值，空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、對照管和測定管吸光值分別記為A1、A2、A3和A4。若A大于2，需將待測樣本用蒸餾水稀釋（可稀釋10倍或20倍）。空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只要做一管，每個測定管需設(shè)一個對照管。

ISP含量計算：

ISP含量(mg /g 干重)= (C標(biāo)準(zhǔn)×V1) ×(A4-A3)÷(A2-A1)÷(W×V1÷V2) ×稀釋倍數(shù)=0.05×(A4-A3)÷(A2-A1)÷W×稀釋倍數(shù)

C標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.05mg/mL；V1：加入樣本體積，0.1mL；V2：加入提取液體積，1mL； W：樣本干重，g。

注意：

低檢測限為50μg /g 干重

離子結(jié)合型果膠(ISP)含量試劑盒操作步驟