γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶（glutamate cysteine ligase，GCL）說明書

                                                       
                                                                    分光光度法50管/48樣

γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶比色法試劑盒

注    意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

GCL 是 GSH 合成的限速酶，GSH 對 GCL 有反饋抑制作用。GCL基因表達受多種因素調節，如氧化劑、抗氧化劑、生長因子和炎癥因子等。GCL活性高低對GSH含量和GSH/GSSG比值有重要影響。

測定原理：

在ATP和Mg2+存在下，GCL催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸；同時ATP去磷酸化產生無機磷分子，通過測定無機磷增加速率，即可計算出GCL活性。

自備儀器和用品：

可見分光光度計、冷凍離心機、水浴鍋、移液器、1mL玻璃比色皿、濃硫酸和蒸餾水。

γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶比色法試劑盒

試劑組成和配制：

試劑一：液體70mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加14mL蒸餾水充分震蕩溶解。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入蒸餾水3.5 mL充分震蕩溶解。

試劑四：液體16mL×1瓶，室溫保存。

試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入30mL蒸餾水，充分震蕩溶解后，緩緩加入1.0 mL濃硫酸（自備），邊加邊攪拌。

粗酶液提取： 

1. 組織：按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2. 細菌、真菌：按照細胞數量（104個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。

3. 血清等液體：直接測定。

γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶比色法試劑盒

GCL測定操作

1. 分光光度計預熱30min，調節波長到660 nm，蒸餾水調零。

2. 空白管：取1.5mLEp管，依次加入試劑一240 µL、試劑二260µL、試劑三60µL和蒸餾水120µL，混勻后蓋緊，37℃水浴準確反應15 min； 再加入試劑四300µL，混勻后，25℃、8000g，離心10 min，取上清500µL，加入試劑五500µL，混勻后蓋緊，45℃水浴10min，冷卻后測定660 nm處吸光值，記為A空白管。

3. 測定管：取1.5mLEp管，依次加入試劑一240 µL、試劑二260µL、試劑三60µL和上清液120µL，混勻后蓋緊，37℃水浴準確反應15 min； 再加入試劑四300µL，混勻后，25℃、8000g，離心10 min，取上清500µL，加入試劑五500µL，混勻后蓋緊，45℃水浴10min，冷卻后測定660 nm處吸光值，記為A測定管。

注意：空白管只需要測定一次。

GCL活性計算公式：

標準曲線：y=0.1427x，R2=0.9987

(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義：37℃下，每毫克蛋白每分鐘催化產生1μg無機磷的GCL酶活量為1個酶活單位。

GCL（μg/min /mg prot）=[（A測定管-A空白管）÷0.1427×V反總]÷(Cpr×V樣)÷T

=3.815×（A測定管-A空白管）÷Cpr

（2）按樣本質量計算

活性單位定義：37℃下，每克組織每分鐘催化產生1μg無機磷的GCL酶活量為為1個酶活單位。

GCL（μg/min /g鮮重）= [（A測定管-A空白管）÷0.1427×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T

= 3.815×（A測定管-A空白管）÷W

（3）按細胞數量計算

活性單位定義：37℃下，每104個細胞每分鐘催化產生1μg無機磷的GCL酶活量為1個酶活單位。

GCL（μg/min /104 cell）=[（A測定管-A空白管）÷ 0.1427×V反總]÷(細胞數量×V樣÷V樣總)÷T

= 3.815×（A測定管-A空白管）÷細胞數量

（4）按照液體體積計算

活性單位定義：37℃下，每毫升液體每分鐘催化產生1μg無機磷的GCL酶活量為1個酶活單位。

GCL（μg/min /mL）= [（A測定管-A空白管）÷ 0.1427×V反總]÷V樣÷T

=  3.815×（A測定管-A空白管）

0.1427：回歸方程系數；V反總：反應總體積（mL）980µL=0.980mL；Cpr：上清液蛋白質濃度，mg/mL；V樣：加入反應體系中上清液體積，120µL =0.12 mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣本質量，g；T：反應時間：15min。

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注意事項：

（1）樣品處理等過程均需要在冰上進行，且須在當日測定酶活力，以免影響其活力。如果是勻漿液，避免反復凍融。

（2）所有試劑配制完后，除表明4℃保存外，請于1天內用完。

（3）實驗過程請帶手套，試劑三中有強腐蝕性物質，注意不要濺到皮膚上或眼睛內。

（4）測定吸光值時請于水浴后10～40分鐘內測完。

（5）樣本測定前先取1-2個樣做預實驗，如吸光值太高，應先用試劑一(或者生理鹽水)稀釋到適當倍數，使得吸光值在標準曲線范圍內，哺乳動物組織和血液一般稀釋3～5倍。

（6）試劑三配制過程中，可能會產生黑色固體，其不影響結果，注意吸取時不要將黑色固體吸入。

（7）細胞中GCL活性測定時，細胞數目須在300萬-500萬之間，細胞中GCL的提取時可加試劑一（或生理鹽水）后研磨或超聲波處理，不能用細胞裂解液處理細胞；γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶比色法試劑盒