外泌體是包含了復(fù)雜RNA和蛋白質(zhì)的小膜泡，是細胞間信號傳輸?shù)妮d體。多種細胞在正常及病理狀態(tài)下均可分泌外泌體，它們廣泛存在于血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁等體液中，參與細胞間通訊。近年來，外泌體的研究熱度持續(xù)攀升，在2019年國家自然科學(xué)基金獲批項目中，外泌體研究相關(guān)項目的總數(shù)突破500個，立項的總金額突破2億元。但由于外泌體的尺寸（30~200 nm），常規(guī)的光學(xué)顯微鏡無法對其進行成像分析，因此很少有技術(shù)能夠?qū)蝹€外泌體進行物理表征和蛋白分型。

美國NanoView Biosciences公司推出了全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)ExoView系統(tǒng)，采用了SPIRS成像技術(shù)，只需要少量樣品即可一次完成外泌體計數(shù)、粒徑、蛋白表達、蛋白共定位、亞群分布的分析。全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)ExoView于2018年被推出后，便引起了外泌體領(lǐng)域科研工作者的廣泛關(guān)注，目前已近100多個實驗室采用該技術(shù)，發(fā)表文獻超過150篇。進入2022年，使用ExoView發(fā)表的論文出現(xiàn)井噴性增長，短短數(shù)月已經(jīng)發(fā)表了近50篇。本文選取了三篇在高水平期刊《Journal of   Extracellular Vesicle》（JEV）發(fā)表的比較有代表性的文章，來說明ExoView在血樣本、光誘導(dǎo)、心功能不全等研究領(lǐng)域的具體應(yīng)用。

四跨膜蛋白區(qū)分人血清和血漿中不同外泌體亞群-血漿中血小板外泌體的貢獻

早期研究證明從血液中分離外泌體的能力對于將外泌體開發(fā)為疾病的生物標志物至關(guān)重要，尤其是從血漿和血清中分離外泌體，但很少有研究系統(tǒng)地比較這些來源的外泌體類型。Nasibeh Karimi等^[1]對確定血漿和血清中不同外泌體亞群的存在進行了研究。研究人員采集健康受試者血液，分別用   K2E EDTA 采血管和 ACD-A采血管收集血漿，同時用血清凝塊激活劑管收集血清，然后利用ExoView、Western blot、ELISA 和質(zhì)譜等技術(shù)分析分離出的外泌體亞群。結(jié)果表明人類血液中含有多個攜帶不同四跨膜蛋白的外泌體亞群，使用不同的抗凝劑和離心方法，會影響外泌體亞群的分析。

其中，研究人員使用ExoView對從血漿（EDTA）、血清以及人肥大細胞系分離的外泌體進行檢測，結(jié)果顯示在血漿和血清的樣本中，血小板蛋白CD41a抗體捕獲較多的是CD9+外泌體。與血清相比，血漿中的CD9+外泌體更多，并且是從血小板釋放的（圖1 a,b,c），然而血清中的CD63+/CD41a+外泌體的數(shù)量高于血漿（EDTA）（圖1 m,n），這與之前的磁珠ELISA法的結(jié)果保持一致。另外，在血漿、血清樣本中，被CD81抗體捕獲的外泌體的CD63+比例較低，而CD9+比例較高（圖1 a,b,d,e,g,h），進一步驗證了早先的研究結(jié)果，但是在人類肥大細胞系的樣本中，研究人員沒有觀察到這種差異（圖1 c,f,i,l）。另一方面，粒徑分析的結(jié)果顯示CD41a和CD9抗體捕獲的外泌體的粒徑相對較小，表明捕獲的外泌體是單外泌體，而不是外泌體聚合物（圖1 o）。

圖1 ExoView檢測從血漿、血清、人肥大細胞系分離的外泌體的數(shù)量、共定位和粒徑

光誘導(dǎo)免疫功能外泌體的高效產(chǎn)生

基于外泌體的治療方法和疫苗正在不斷興起，然而基于臨床應(yīng)用劑量規(guī)模的研發(fā)始終是一個巨大的瓶頸。為了克服這樣的障礙，Shaobo Ruan^[2]等開發(fā)了一種簡單直接的方法，通過利用近紫外LED燈（365 nm）的光感應(yīng)來促進樹突狀細胞分泌外泌體 (DEV)。體外和體內(nèi)實驗的結(jié)果顯示，近紫外波長不會損害細胞生長，使DEV生產(chǎn)率提高了13倍以上，同時讓DEV保持了良好的生物相容性和高度免疫性，使其成為理想的治療平臺。

其中，研究人員使用ExoView對DEV的免疫性標記物進行檢測，把樣品組分為未處理的成熟樹突狀細胞來源的外泌體（mDEVs）、未處理的未成熟樹突狀細胞來源的外泌體（imDEVs）、近紫外光照射的成熟樹突狀細胞來源的外泌體（UV-mDEVs）、近紫外光照射的未成熟樹突狀細胞來源的外泌體（UV-imDEVs）。結(jié)果顯示在所有的分組中，CD9抗體捕獲的外泌體數(shù)量始終比CD81抗體捕獲高4倍多，這表明大多數(shù)DEV具有CD9表達，但可能不具有CD81表達（圖2 b,c,d)。CD63是外泌體中常見的結(jié)構(gòu)和功能蛋白，這使得CD63+外泌體數(shù)量遠高于MHC-I+、MHC-II+、CD86+。以CD63作為內(nèi)部參考，研究人員進行了兩次平行實驗以評估MHC-I/MHC-II與CD86的表達水平(圖2 c,d)。使用歸一化方法計算總捕獲DEV的生物標記物的相對百分比，結(jié)果表明mDEVs的MHC-I、MHC-II和CD86表達略高于imDEVs的表達（圖2 g,h）。該結(jié)果與早先研究結(jié)果一致，即mDEVs具有更強的免疫反應(yīng)誘導(dǎo)性。此外，CD63/MHC-I/CD86、CD63/MHC-II/CD86、MHC-I/CD86、MHC-II/CD86或CD63/CD86的共表達在不同的 DEV條件下以及有或沒有進行光處理沒有明顯變化，盡管單獨的MHC-I或MHC-II在光處理后表現(xiàn)出輕微的減少（圖2 e,f），這證明光誘導(dǎo)對DEV的免疫標記表達幾乎沒有影響。在 DEV上保留必要的免疫標志物對于免疫反應(yīng)至關(guān)重要。

圖2 ExoView檢測mDEVs、imDEVs、UV-mDEVs、UV-imDEVs的免疫性標記物的數(shù)量、共定位以及進行熒光成像

含miR-421的外泌體與空氣污染（PM2.5）誘導(dǎo)心功能不全的發(fā)生機制相關(guān)

大氣細顆粒物（PM2.5，空氣動力學(xué)直徑≤2.5μm）是空氣污染的主要原因。越來越多的證據(jù)表明，大氣PM2.5濃度的升高與總死亡率呈正相關(guān)，尤其是心血管疾病和呼吸系統(tǒng)疾病的死亡率。 PM2.5急性/亞急性暴露對人體的危害不容忽視，但是對于呼吸系統(tǒng)亞急性暴露于PM2.5所誘發(fā)心臟功能不全的分子機制尚不明確。上海大學(xué)王紅云[3]等在大氣污染相關(guān)的心血管疾病研究方面取得新進展，揭示了大氣PM2.5亞急性暴露引發(fā)心功能不全的新的分子機制：大氣PM2.5亞急性暴露在肺損傷后促進外泌體釋放其攜帶的miR-421，通過抑制ACE2導(dǎo)致 PM2.5誘導(dǎo)的心功能不全。

其中，研究人員使用ExoView對從暴露于PM2.5的細胞上清液提取的外泌體以及對照組進行檢測。結(jié)果顯示，與對照組相比，PM2.5組的外泌體數(shù)量顯著比對照組多（圖3 a）。另外，粒徑的結(jié)果顯示了兩組外泌體的粒徑大小接近（圖3 d）。多色熒光成像圖表明，與對照組相比，PM2.5暴露增加了 CD63/CD81/CD9 共定位外泌體的數(shù)量（圖     3 c）。這些數(shù)據(jù)證明了PM2.5 暴露可顯著增加CD63+、CD81+和CD9 +外泌體。

圖3 ExoView檢測從暴露于PM2.5的細胞上清液提取的外泌體和對照組外泌體的計數(shù)、粒徑以及進行熒光成像

在上述三篇文章中，科學(xué)家借助美國NanoView Biosciences公司研發(fā)的全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)ExoView，直接檢測樣本中的外泌體，無需純化，操作簡單。一次結(jié)果直接輸出外泌體粒徑，數(shù)目，蛋白表型，不同亞群的含量、多色熒光成像圖。三篇文章分別從血樣本、光誘導(dǎo)、心功能不全等研究領(lǐng)域介紹了ExoView的無需純化，全面表征的特點，有力地證明ExoView是外泌體檢測的一大利器。

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? 上海大學(xué)在《Journal of extracellular vesicles》發(fā)表文章。

? 中國科學(xué)院深圳技術(shù)研究院在《Lab on a Chip》發(fā)表文章。

?  北京天壇醫(yī)院、國家納米科學(xué)中心、北京航空航天大學(xué)在《Advanced Science》發(fā)表文章。

?  同濟大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院、上海思路迪轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)在《Journal of Nanobiotechnology》發(fā)表文章。

? 山東千佛山醫(yī)院在《NANO LETTERS》發(fā)表文章

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參考文獻：

[1] Nasibeh Karimi, Razieh Dalirfardouei,   Tomás Dias, Jan Lötvall, Cecilia Lässer. (2022) Tetraspanins distinguish separate extracellular vesicle subpopulations in human serum and plasma –  Contributions of platelet extracellular vesicles in plasma samples. Journal of Extracellular Vesicles, https://doi.org/10.1002/jev2.12213.

[2] Shaobo Ruan, Nina Erwin, Mei He. (2022) Light-induced high-efficient cellular production of immune functional extracellular vesicles.  Journal of extracellular vesicles,   https://doi.org/10.1002/jev2.12194.

[3] Hongyun Wang, Tianhui Wang, Wei Rui, Jinxin Xie, Yuling Xie, Xiao Zhang, Longfei Guan, Guoping Li, Zhiyong Lei, Raymond M Schiffelers, Joost P G Sluijter, Junjie Xiao. (2022) Extracellular vesicles enclosed-miR-421 suppress air pollution (PM2.5)-induced cardiac dysfunction via ACE2 signaling. Journal of Extracellular Vesicles, https://doi.org/10.1002/jev2.12222.

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1、全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)

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