一、樣品前處理

1、所用試劑

1.1 Loading Buffer：鋰鹽系統(tǒng)，pH 2.2

1.2 磺基水楊酸溶液：取50g磺基水楊酸溶于1L純水中

1.3 乙二胺四乙酸二鈉溶液：取10g EDTA-Na溶于1L純水中

1.4 0.06mol/L 鹽酸：取50mL 鹽酸加水稀釋至10mL,混勻

1.5 5種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品、Cystine單標(biāo)

2、前處理設(shè)備

1) 分析天平:精度為 0.0001g

2) 移液槍及槍頭

3) 0.22um濾膜

4) 一次性注射器

5) 低范圍pH試紙

3、樣品制備（參考NY/T 1975-2010）

因樣品為透明膠質(zhì)類物質(zhì)，且可能含有未知大分子等雜質(zhì)，故需(參考NY/T 1975)進(jìn)行除蛋白前處理：

吸取2 mL樣品于10 mL離心管或試管中,準(zhǔn)確加人2 mL磺基水楊酸溶液(1.2)，混勻,放置1h。準(zhǔn)確加入1 mL EDTA-Na溶液(1.3)和1 mL鹽酸溶液(1.4),混勻,離心15 min(或用0.45um的微孔濾膜過濾)。吸取上清液(或?yàn)V液)1 mL(測(cè)定當(dāng)前pH，若有需要?jiǎng)t可加少許的Loading Buffer (1.1),使氨基酸濃度處于儀器檢測(cè)范圍內(nèi))，移液槍取上述溶液1mL至一次性注射劑，過濾膜，上機(jī)待測(cè)。

二、分析方法描述（Biochrom 30+）

氨基酸分析儀分析方法參數(shù)：

1) 色譜柱：Biochrom Li型陽離子交換樹脂柱，4.6*20cm

2) 分離程序：

3) 運(yùn)行時(shí)間：經(jīng)分析時(shí)間+再生時(shí)間 168.15min

4) 反應(yīng)單元溫度：135°C。

5) 檢測(cè)波長：570nm、440nm同時(shí)檢測(cè)。

三、樣品中氨基酸含量的計(jì)算

樣品測(cè)定液氨基酸的含量按式(1)計(jì)算:

C_i = C_s/A_s × A_i× F ················· (1)式中:

C_i ———樣品測(cè)定液氨基酸i的含量,單位為納摩爾每毫升(nmol/mL);

C_s ———氨基酸標(biāo)準(zhǔn)工作液氨基酸s的含量,單位為納摩爾每毫升(nmol/mL);

A_i ———試樣測(cè)定液氨基酸i的峰面積;

A_s ———氨基酸標(biāo)準(zhǔn)工作液氨基酸s的峰面積;

F ———樣品稀釋倍數(shù)。

附：透明膠質(zhì)類物質(zhì)中，高溫滅菌前后比較的游離氨基酸，分析圖譜及做樣結(jié)果：

由結(jié)果可知：高溫滅菌之后的游離氨基酸含量，相較于滅菌前會(huì)有少許提升。這是由于滅菌前的樣品中可能含有的少許干擾物質(zhì)或雜菌，存在經(jīng)過高溫滅菌等的處理會(huì)被破壞，釋放少許的氨基酸的可能，屬合理正?，F(xiàn)象。

圖1.  樣品A--滅菌前—Tau、Glu、Gly、Val+Cystine

圖2.  樣品B--滅菌后—Tau、Glu、Gly、Val+Cystine