上期我們了解到在 SILAC 的實驗中會用到同位素標記的氨基酸，而體內的代謝實驗中是否也會有專門的同位素標記物的使用呢？今天就和 M 君一起來看下體內代謝實驗中同位素標記物的應用吧

穩定同位素標記物是研究代謝的有力工具，越來越多地用于體內代謝研究，穩定同位素標記物在體內代謝研究中已經解決了許多生物學問題，如：代謝路徑的確認、疾病機理的探索、新調控原理的發現、新治療靶點及生物標志物的確認、新診斷方法的實施及個性化治等[1]。
穩定同位素標記物在代謝研究中這么重要，一般都有哪些同位素標記物的示蹤劑呢?它們是如何區別并應用的呢？跟著 M 君繼續來了解吧~

常用的示蹤劑有穩定和放射兩種同位素示蹤劑，穩定同位素示蹤劑因其標記方式靈活多樣、示蹤時長不受半衰期限制、給藥方式多樣及示蹤通路研究較多等而受到體內代謝研究實驗的追捧。

穩定同位素示蹤劑應用較多的為含氘 (2H)、碳-13 (13C)、碳-15 (15N)、氧-18 (18O) 等的同位素標記物，全標記的示蹤劑具有作為全局示蹤劑的潛力目前廣泛用于代謝研究中，它們可以一次將標記轉移到多個下游途徑中，研究多個通量，如全 13C 標記的葡萄糖 (D-Glucose-13C₆) 和谷氨酰胺 (L-Glutamine-13C₅) 等，通過給藥體內，可分析下游代謝產物，找出上下游代謝途徑及其它們的內在關系、代謝產物的組成和含量等，甚至研究細胞代謝的動態變化。

圖 1. R. solanacearum F1C1 中通過13C標記確認OxPPP 和 Non-OxPPP 代謝途徑^[2]。

而特定位置標記的穩定同位素示蹤劑因其在特定位置的同位素原子會轉移到特定的代謝物中，對研究特定通路方面具有明顯優勢，目前也被廣泛應用于體內代謝研究匯中，如有 [1-13C]-glucose 和 [1，2-13C]-glucose 在研究葡萄糖是參與的有氧化磷酸戊糖 (OxPPP) 還是非氧化磷酸戊糖 (Non-OxPPP) 途徑中發揮了重大作用[2]。用 3 個 13C 標記的果糖 [1,2,3-13C or 4,5,6-13C]-fructose 示蹤劑，通過使用在果糖標記在前 3個碳原子，后 3個碳原子的不同位置標記物，揭示了果糖主要通過甘油在小鼠小腸中分解為有機酸的過程[3]。

圖 2. 小鼠接受未標記的葡萄糖和部分標記的果糖 (碳 1,2,3 或 4,5,6 標記)的 1:1 混合物。循環甘油，以及在較小程度上幾種其他有機酸，優先由果糖的碳 4、5、6 形成。紅線表示碳 1、2、3 與碳 4、5、6 的標記相等 (1、2、3 的 N = 4, 4、5、6 的 N = 3) ^[3]。

不同的同位素示蹤劑有不同的用途，那我們要如何選擇呢？M君帶你進入了解大咖是如何篩選及后處理同位素的體內代謝實驗的!  

如何篩選穩定同位素示蹤劑來進行體內代謝實驗呢？Juan Fernández-Garcí 教授等人對用不同穩定同位素做體內示蹤實驗的文獻做了匯總，并總結了體內示蹤實驗總流程圖，具體的過程如下：

1. 根據實驗目的選擇合適的穩定同位素示蹤劑，示蹤劑的選擇必須有某個代謝途徑來驅動，這些代謝途徑的研究正好解決目前實驗需要解決的生物學問題，然后用不同方法摻入模型生物體內，如輸液/注射、灌胃/飲食等。
2. 根據實驗目的選擇，從受試者身上收集組織或者血液樣本。
3. 對收集的樣本代謝物的提取，如組織樣本處理時要控制好溫度和時間，減少對代謝的擾動。
4. 上機檢測。根據提取的代謝物，使用質譜 (MS) 或者核磁 (NMR) 等分析技術，檢測代謝物。
5. 數據分析。根據示蹤劑與下游代謝物的檢測情況，評估不同代謝物的同位素富集。根據所檢測代謝物數據分析，依據系統代謝模型，確認代謝物狀態及途徑。

圖 3. 體內示蹤實驗總流程圖^[1]。

此時穩定同位素在體內代謝研究中的應用已掌握了吧？下面 M 君給出一點小Tips:

在篩選穩定同位素示蹤劑做體內代謝實驗時，建議參考以下幾點建議：

1. 同位素標記物的穩定性：穩定同位素標記物要在體內穩定存在，且不干擾生物體的正常代謝過程。
2. 同位素標記物的代謝途徑：在體內代謝實驗中，需了解所選擇穩定同位素標記物的代謝途徑和產物。標記物要被代謝，不干擾實驗結果。
3. 同位素標記物的使用方法：在體內代謝實驗中，需了解如何在體內摻入穩定同位素標記物及實驗方法，后續的樣品處理和數據分析。
4. 同位素標記物的成本：標記物價格比非標記物要貴些，要權衡考慮實驗數量和實驗周期等因素，參考實驗預算，以保證實驗順利完成。

小 M 已和您共同學習了穩定同位素在體內代謝實驗中的應用，您是否也正好在做類似的實驗呢？可以瀏覽下 MCE 的穩定同位素標記物，你想要的我都有！

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參考文獻：
[1] Fernández-García J, Altea-Manzano P, Pranzini E, Fendt SM. Stable Isotopes for Tracing Mammalian-Cell Metabolism In Vivo. Trends Biochem Sci. 2020 Mar;45(3):185-201

[2] Jyoti P, Shree M, Joshi C, Prakash T, Ray SK, Satapathy SS, Masakapalli SK. The Entner-Doudoroff and Nonoxidative Pentose Phosphate Pathways Bypass Glycolysis and the Oxidative Pentose Phosphate Pathway in Ralstonia solanacearum. mSystems. 2020 Mar 10;5(2):e00091-20.

[3] Jang C, Hui S, Lu W, Cowan AJ, Morscher RJ, Lee G, Liu W, Tesz GJ, Birnbaum MJ, Rabinowitz JD. The Small Intestine Converts Dietary Fructose into Glucose and Organic Acids. Cell Metab. 2018 Feb 6;27(2):351-361.e3.