1971 年，Judah Folkman 教授提出 “腫瘤生長和轉移依賴于血管新生” 理論，認為新血管的形成對于腫瘤生長和轉移至關重要。血管生成和細胞侵襲怎樣設計實驗？想要具體實驗 Protocol？ 一文帶你走進熱門實驗技術，為發表高分文獻提供新思路，“膠”你做實驗！

基底膜是一層特化薄而柔韌的胞外基質 (無細胞薄膜狀結構)，位于上皮細胞基底面與深部結締組織間。基底膜在發育和傷口愈合時會發生退化及再生，它不僅為細胞和細胞層提供支持，也為血管生成提供其所必需的環境，還是轉移性腫瘤細胞侵襲的主要屏障。此外，基底膜還可通過影響細胞粘附、遷移、增殖和分化對組織形成產生重要作用[1]。

圖 1. 間質基質和基底膜的組成^[1]。

基底膜基質膠 (Basement Membrane Matrix) 是從富含胞外基質蛋白的小鼠腫瘤中提取出的天然基底膜基質，主要成分是各類生長因子及細胞外基質成分。

Tips!

基質膠主要細胞外基質成分有：層粘連蛋白 (Laminin)、IV 型膠原蛋白 (Col-IV)、巢蛋白 (Entactin)、硫酸乙酰肝素蛋白多糖 (Heparan sulphate proteoglycans) 等。

基質膠也包含多種生長因子，例如：類胰島素生長因子 (IGF-1)、轉化生長因子  β (TGF-β)、血管內皮生長因子 (VEGF)、表皮生長因子 (EGF)、成纖維細胞生長因子 (bFGF) 等。

基于基底膜基質膠的組成及特性，基底膜基質膠對于體外模擬細胞體內生長環境提供了非常重要的支持，其應用包括免疫缺陷型小鼠體內腫瘤形成、類器官培養、腫瘤細胞侵襲實驗、體外和體內血管生成研究、干細胞的維持、擴增和分化等。

MCE 基質膠產品適用多個研究領域，批次間穩定性高，部分產品如下：

腫瘤組織具有高度血管化的特征，腫瘤的生長依賴于新生血管。由于血管生成 (Angiogenesis) 對腫瘤生長和侵入轉移、特別對腫瘤早期發生的重要影響，已成為近年來腫瘤研究的熱點之一。

由于內皮細胞在基底膜提取物上培養時可形成三維毛細血管樣管狀結構，血管生成實驗成為一種簡單、定量、可靠且功能強大的模型，常用于研究抑制劑和激活劑對血管生成的影響。

?【實驗步驟】
1. 準備基質膠

實驗前一天將 -20℃ 保存的基質膠埋于碎冰放入 4 ℃ 冰箱，使基質膠過夜緩慢融化。實驗開始前，將基質膠放在冰盒中，將 96 孔板和 1 mL 槍頭放置在冰上預冷，基質膠用預冷槍頭混勻。

2. 鋪基質膠

準備預冷的 1.5 mL 離心管用于稀釋基質膠，以基質膠: DMEM 培養基為 1:1 或 2:1 的稀釋比稀釋。稀釋后向 96 孔板每孔加入 50-80 µL 稀釋后的基質膠，垂直加入避免產生氣泡。在 37℃ 培養箱中放置 45 分鐘~1 小時使基質膠凝固。

3. 鋪細胞

使用 3-5 代狀態較好的 HUVEC 細胞，消化細胞，用含 10% 血清的 DMEM 培養基重懸細胞并計數。96 孔板每孔加入 50-100 µL，3-5 萬個細胞的重懸液，每組重復三孔。將 96 孔板置于 37℃ 培養箱培養，4-12 小時后可見血管形成。

4. 定量分析

使用 ImageJ 中 Angiogenesis Analyzer 插件對血管網絡進行定量統計。

?【結果示例圖】

(A) Aspirin 對基質膠上 HUVEC 管形成的影響; (B) HUVEC 細胞血管形成實驗應用 ImageJ-Angiogenesis Analyzer 分析 (綠色，分支；洋紅，節段；藍色包圍的紅色，接合處；青色，網格；紫色，錨定接合處)。

?【注意事項】

1. 為什么基質膠液面不平有氣泡？

鋪膠時手持移液槍垂直于 96 孔板內孔的正上方垂直加入，防止基質膠沾到孔壁上。當剛加膠時出現明顯的氣泡，可使用吸頭輕觸戳破，后續搖平即可。若孔底部沒有鋪勻，可晃動孔板使其均勻鋪于底部。
2. 成管時間怎么判斷？
成管時間與細胞狀態密切相關。細胞狀態好時，2-3 小時開始成管，細胞狀態較差時，可能 18-24 h 成管；如果使用原代內皮細胞而非永生化細胞，開始成管的時間會延遲幾個小時；建議實驗每 4 個小時觀察一次。

細胞侵襲 (Cell invasion) 是指細胞通過細胞外基質從一個區域遷移到另一個區域的能力，是正常細胞或癌細胞對化學和機械刺激做出的正常反應，通常發生在胚胎發育、血管生成、傷口修復、炎癥反應、免疫反應和癌癥轉移等過程中。

圖 3. Transwell 細胞侵襲試驗示意圖^[4]。

在腫瘤相關研究中，利用 Transwell 小室檢測腫瘤細胞的遷移和侵襲能力十分常見。在 Transwell 小室的聚碳酸酯膜上側鋪一層基質膠模擬細胞外基質，腫瘤細胞分泌基質金屬蛋白酶消化基質進入下室，最后計算下室的細胞量即可反映細胞的侵襲能力。

?【實驗步驟】

1. 準備基質膠

實驗前一天將 -20℃ 保存的基質膠埋于碎冰放入 4℃ 冰箱，使基質膠過夜緩慢融化。實驗開始前，將基質膠放在冰盒中，將 24 孔板和 1 mL 槍頭放置在冰上預冷，基質膠用預冷槍頭混勻。

2. 鋪基質膠

準備預冷的 1.5 mL 離心管用于稀釋基質膠，以基質膠: DMEM 培養基為 1:8 的稀釋比稀釋 (根據細胞分泌基質金屬蛋白酶的含量，稀釋比例需要摸索)。取 60-100 μL基質膠添加到 Transwell 小室上層 (注意不要出現氣泡)，于 37℃ 培養箱中孵育 3 h，使基質膠聚合成薄膜。孵育后將上室中多余液體吸掉，每孔加入 100 μL 無血清培養基后，于 37℃ 培養箱放置 30 min，進行基底膜水化。

3. 鋪細胞

在 24 孔板下室加入 600 μL 含有 10% 胎牛血清的細胞培養基。消化細胞，用 PBS 清洗細胞，使用含有 BSA 的無血清培養基重新懸浮細胞，細胞計數調整細胞密度至 1-10×105個/mL (不同細胞大小和侵襲能力不同，可設置濃度梯度以達到實驗結果)。用鑷子將 Transwell 小室置于 24 孔板內 (注意不要產生氣泡)，取 100-200 μL 細胞懸液，加入 Transwell 小室上層。將 24 孔板置于 37℃ 培養箱培養 24-72 h (依照細胞侵襲能力而定)。

4. 結晶紫染色

棄去細胞培養基，24 孔板加入 500 μL 4% 多聚甲醛固定液固定 30 分鐘，PBS 清洗。加入 500 μL 結晶紫溶液，染色 30 分鐘，使用 PBS 清洗去除浮液。適當風干后即可進行顯微鏡觀察、拍照和統計學分析。

?【結果示例圖】

圖 4. MDA-231 細胞和 MDA-231-HM 細胞的侵襲實驗^[5]。

?【注意事項】

1. 結晶紫染色后細胞分布不均一？

可能原因：Transwell 小室傾斜放置在孔板中；細胞消化不；細胞懸液添加不均勻；基質膠膠面不均勻。

2. Transwell 小室下層細胞過少？

可能原因：細胞的侵襲能力弱；基質膠濃度偏高厚度偏厚；細胞接種數量少；Transwell 小室孔徑偏小；Transwell 小室放入孔板時有氣泡等。

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本期為大家介紹了血管生成和細胞侵襲的實驗設計和注意事項，各位小伙伴們！或許你有其他想要了解的實驗 Protocol？ 小 M 歡迎大家留言評論，安排您的 “專屬” 實驗操作指南或相關主題講座喔~  
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參考文獻：
[1] Bonnans C, et al. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2014 Dec;15(12):786-801.
[2] Dai X, et al. Aspirin Inhibits Cancer Metastasis and Angiogenesis via Targeting Heparanase. Clin Cancer Res. 2017 Oct 15;23(20):6267-6278.
[3] Carpentier G,et al. Angiogenesis Analyzer for ImageJ - A comparative morphometric analysis of "Endothelial Tube Formation Assay" and "Fibrin Bead Assay". Sci Rep. 2020 Jul 14;10(1):11568.
[4] Justus CR, et al. Transwell In Vitro Cell Migration and Invasion Assays. Methods Mol Biol. 2023;2644:349-359.
[5] Zhu Y,et al. Exosomal MMP-1 transfers metastasis potential in triple-negative breast cancer through PAR1-mediated EMT. Breast Cancer Res Treat. 2022 May;193(1):65-81.