在ELISA中，用酶標記的抗體或抗原統稱為結合物，此為進行ELISA檢測的關鍵試劑。常規使用ELISA法的主要問題是能夠簡便地制備酶結合物，而此種制備好的酶結合物要求穩定，具有很高的酶活性，抗原或抗體的特異性，產量高及成本低。

    那么用什么樣的酶來標記抗原或抗體呢？

    1.酶制品的純度及活力高，催化效力也高，放大倍數大(即一個酶分子能催化幾十幾百個底物分子發生反應的酶)。

    2.酶及制備好的酶結合物在檢測或貯存中能保持穩定。

    3.酶制劑易得、價廉.

    4.既要適用于標記抗原，又適用于標記抗體，標記后不影響抗原或抗體的免疫學特性，也不降低酶的活性。

    5.酶的反應產物穩定，檢測時簡便、快速。在定量測定中產物必須是可溶性的。

    6.要有安全、價廉、易得的底物。

    符合上述條件的酶有：堿性磷酸酶，一般用分子量為5×105(Alkaline Phospatase,簡稱AP)，辣根過氧化物酶(Horse Radish Peroxidase,簡稱HRP,分子量為4×104),另外尚有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖甙酶，糖化酶及乙酰膽堿酯酶等等。其中以前兩種(AP和HRP)zui為常用。

    AP活力高，制備好的酶結合物可加NaN3防腐，但此種酶不易獲得，因其是從小牛腸粘膜中或大腸桿菌中提取，而且價格比較昂貴。因此，目前國內外大多使用HRP。HRP活性也高，價格較便宜。但制得酶結合物不能加NaN3防腐。因NaN3能抑制HRP的活性，但可作低溫保存或加60%緩沖甘油等量混合后少量分裝，保存冰箱，一般可用1-2年。

   結合：用什么樣的方法將HRP與抗體球蛋白結合起來呢？當然不能用強烈的方法，因為強烈的方法會使酶和抗體失去活性。故只能用溫和的方法把酶和抗體結合起來。因此，必須使用結合劑。理想的結合劑應具備下列條件：

1.不影響酶及抗體活性；

2.不產生干擾物質；

3.抗體和酶結合后應有較高的產量；

4.不出現非特異性反應；

5.結合程序簡便；

6.來源易、價廉。

目前常用的有戊二醛和過碘酸鈉二種。由于對所使用結合劑的針對性，因此標記的方法也有戊二醛交聯法和過碘酸鈉氧化法兩類。