小動(dòng)物活體成像技術(shù)是指利用一套非常靈敏的光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，在不損傷動(dòng)物的前提下，對(duì)活體狀態(tài)下的生物體內(nèi)的組織、細(xì)胞和分子水平的定性和定量研究的技術(shù)。通過(guò)這項(xiàng)技術(shù)可以非侵入式、直觀地觀測(cè)活體動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移，感染性疾病的發(fā)展過(guò)程、特定基因的表達(dá)變化等生物學(xué)過(guò)程。

活體光學(xué)成像技術(shù)，主要包括生物發(fā)光（Bioluminescence）與熒光（Fluorescence）兩種技術(shù)。生物發(fā)光技術(shù)是用熒光素酶（Luciferase）基因標(biāo)記細(xì)胞或者DNA，而熒光技術(shù)則是應(yīng)用熒光蛋白（如GFP,RFP,Mcherry等）標(biāo)記細(xì)胞或蛋白等研究對(duì)象。其中生物發(fā)光技術(shù)因其操作簡(jiǎn)單，背景噪音低，靈敏度高，結(jié)果直觀等優(yōu)點(diǎn)，在腫瘤，分子互作及信號(hào)傳導(dǎo)等研究中得到了廣泛應(yīng)用。

熒光素酶報(bào)告基因

報(bào)告基因（Reporter Gene）：通常指可編碼某種蛋白或酶，其表達(dá)產(chǎn)物容易被檢測(cè)，并且能與內(nèi)源性背景蛋白相區(qū)別的基因，通過(guò)它的表達(dá)產(chǎn)物來(lái)標(biāo)定目的基因的表達(dá)調(diào)控。

理想的報(bào)告基因必須具備哪些條件？

1.編碼的表達(dá)產(chǎn)物必須與細(xì)胞內(nèi)源性的所有基因相區(qū)別，編碼產(chǎn)物的活性不受宿主細(xì)胞的干預(yù)。

2.有快速簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、靈敏的檢測(cè)方法，且重現(xiàn)性好、結(jié)果可靠，測(cè)量數(shù)據(jù)應(yīng)該有較寬的線性范圍。

3.細(xì)胞內(nèi)的其他基因產(chǎn)物不會(huì)干擾報(bào)告基因產(chǎn)物的檢測(cè)，同時(shí)報(bào)告基因的表達(dá)也不改變宿主細(xì)胞的生理功能。

常用的熒光素酶有哪些？

熒光素酶（Luciferase）是自然界中能發(fā)出熒光的酶的統(tǒng)稱。他們可以通過(guò)酶促反應(yīng)催化底物產(chǎn)生自發(fā)熒光。熒光素酶因其便于檢測(cè)和靈敏度高等特性常作為報(bào)告基因被廣泛用于生化檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中。其中應(yīng)用泛的是螢火蟲(chóng)熒光素酶（Firefly luciferase）和海腎熒光素酶（Renilla luciferase）。

螢火蟲(chóng)熒光素酶的發(fā)射波長(zhǎng)560nm,在體內(nèi)會(huì)紅移至610nm,組織穿透性更好，適用于動(dòng)物內(nèi)臟等較深部位的組織成像。優(yōu)點(diǎn)包括底物不產(chǎn)生本底光源，底物干凈，對(duì)照組的設(shè)置就相對(duì)容易。但缺點(diǎn)也有，相對(duì)分子質(zhì)量較大，在62-64kDa，不適宜轉(zhuǎn)一些小細(xì)胞或細(xì)菌，影響表達(dá)效果；同時(shí)，需要鎂離子及ATP的參與才能發(fā)生酶促反應(yīng)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，一些能量代謝，對(duì)鎂離子或ATP特別靈敏的實(shí)驗(yàn)，要注意檢測(cè)手段對(duì)結(jié)果波動(dòng)的影響。但普通的腫瘤或干細(xì)胞檢測(cè)，則不影響檢測(cè)效果。

海腎熒光素酶的發(fā)射波長(zhǎng)480nm，此波段小鼠的皮膚、毛發(fā)、血液、臟器對(duì)光的吸收較強(qiáng)，因此其產(chǎn)生的藍(lán)光組織穿透能力較弱，適用于動(dòng)物淺表組織成像；優(yōu)點(diǎn)是相對(duì)分子質(zhì)量較小，可用于一些小的細(xì)胞及細(xì)菌，發(fā)光過(guò)程不消耗ATP及鎂離子。但缺點(diǎn)是底物會(huì)有一定的本底光源，底物打入小鼠后，也會(huì)有微弱的信號(hào)，此時(shí)對(duì)照組的設(shè)置要求相對(duì)就嚴(yán)格一些。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模侠碓O(shè)計(jì)我們的實(shí)驗(yàn)方案，選取合適的熒光素酶，建立穩(wěn)定的細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物后，注射適當(dāng)?shù)纳锇l(fā)光底物即可進(jìn)行活體成像設(shè)備的拍攝研究。

活體成像生物發(fā)光的標(biāo)記原理

活體動(dòng)物生物發(fā)光成像，是將熒光素酶基因整合到細(xì)胞染色體DNA上以表達(dá)熒光素酶，當(dāng)外源（腹腔或靜脈注射）給予其底物熒光素（luciferin），即可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。當(dāng)?shù)孜镞^(guò)量時(shí)，產(chǎn)生的光量子數(shù)與熒光素酶的濃度呈正相關(guān)性，檢測(cè)方便，定量準(zhǔn)確，在生物技術(shù)領(lǐng)域有非常廣泛的應(yīng)用。

常用的底物給藥方式有腹腔注射和尾靜脈注射

腹腔注射：迅速分布全身，并穿過(guò)包括大腦在內(nèi)的血液組織屏障；注射底物后10～20 分鐘進(jìn)入成像平臺(tái)期，發(fā)光信號(hào)達(dá)到峰值并逐漸減少；2h后信號(hào)消失，不可檢測(cè)。

尾靜脈注射：可提供更高的發(fā)光強(qiáng)度，5～10倍的高信號(hào)，但是注射難度較高，代謝快。底物注射后約2min進(jìn)入信號(hào)峰值，約30min后信號(hào)消失。

建議：第一次使用熒光素酶底物成像，或者更換新品牌底物，需要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，觀察底物在何時(shí)達(dá)到峰值。確定注射熒光素底物和成像之間的最佳延遲，然后將此時(shí)間用于所有實(shí)驗(yàn)，以標(biāo)準(zhǔn)化成像數(shù)據(jù)。生物發(fā)光信號(hào)的動(dòng)力學(xué)具有組織依賴性。建議每5-10min對(duì)動(dòng)物進(jìn)行一次成像，最多40min，為每個(gè)新建模型創(chuàng)建一個(gè)發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線。常見(jiàn)信號(hào)峰值時(shí)間點(diǎn)在10-15min左右，熒光反應(yīng)發(fā)光一般在30min后衰減，3h后消失。

逐典D-熒光素鉀鹽

逐典D-熒光素鉀鹽，其優(yōu)點(diǎn)在于純度高（HPLC>=99%）,經(jīng)驗(yàn)證的優(yōu)異的生物發(fā)光性能，以及高溶解度。游離形式的熒光素溶解度較差，而鉀鹽形式能做到較好的水溶性，逐典開(kāi)發(fā)的高純度D-熒光素鉀鹽溶解度可達(dá)40mg/ml以上。活體成像試驗(yàn)中，建議注射量在150mgD-熒光素鉀鹽/kg鼠體重（如對(duì)于體重為10g 的小鼠，需要注射100 μL 以提供1.5 mg D-螢光素鉀鹽）。

IVIS Lumina III 小動(dòng)物活體成像平臺(tái)

IVIS Lumina III是Revvity推出的第三代小動(dòng)物活體光學(xué)二維成像平臺(tái)。該系統(tǒng)秉承了前幾代IVIS系列共有的作為業(yè)內(nèi)金標(biāo)準(zhǔn)的高靈敏度生物發(fā)光二維成像性能，并且進(jìn)一步優(yōu)化了熒光二維成像性能，將濾光片標(biāo)準(zhǔn)配置數(shù)量增加至26個(gè)，同時(shí)引入了作為熒光多光譜成像金標(biāo)準(zhǔn)的純光譜分析技術(shù)（CPS），使得Lumina III成為同時(shí)擁有生物發(fā)光及熒光二維成像金標(biāo)準(zhǔn)的高性能活體成像平臺(tái)。

主要特點(diǎn)

•高靈敏度生物發(fā)光二維成像

•高性能熒光二維成像,配備高品質(zhì)濾光片及光譜分離算法，可實(shí)現(xiàn)自發(fā)熒光扣除及多探針成像

•基于切倫科夫輻射原理的放射性同位素成像