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各類聚合酶鏈式反應(PCR)技術特性及缺點

來源:上海撫生實業有限公司   2024年10月21日 15:23  

      PCR (polymerase chain reaction)聚合酶鏈式反應,是體外DNA擴增技術之一,至今已經超過30年的歷史。

PCR基本原理:

PCR可以將目標DNA片段擴增一百萬倍以上,其原理是在DNA聚合酶催化下,以母鏈DNA為模板,以特定引物為延伸起點,通過變性、退火、延伸等步驟,體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程。

標準 PCR 過程分為三步:

1.變性(Denaturation):利用高溫使DNA 雙鏈分離。DNA雙鏈之間的氫鍵在高溫下(93- 98℃)被打斷。

2.退火(Annealing):在 DNA 雙鏈分離后,降低溫度使得引物可以結合于單鏈DNA 上。

3.延伸(Extension):DNA 聚合酶由降溫時結合上的引物處開始沿著DNA 鏈合成互補鏈,延伸完成,則完成一輪循環,DNA片段數增加一倍。

往復循環這三個步驟25-35 次,DNA 片段數將得到指數級增加。

PCR的巧妙之處在于針對不同的目標基因可以設計不同的引物,使目標基因片段在短時間內得到百萬級的放大。

目前為止,PCR可以分為三類,分別是普通PCR、熒光定量PCR和數字PCR。

第一代普通PCR

采用普通PCR 擴增儀來對靶基因進行擴增,然后采用瓊脂糖凝膠電泳對產物進行檢測,只能做定性分析。

第一代PCR主要缺點:

容易發生非特異性擴增和假陽性結果。

檢測耗時長,操作繁瑣。

只能做定性檢測。

第二代熒光定量PCR

熒光定量PCR(Real-Time PCR),也叫做qPCR,通過在反應體系中加入能夠指示反映進程的熒光探針,通過熒光信號的積累來監測擴增產物的積累,通過熒光曲線來判斷結果,并可以借助Cq 值和標準曲線來定量。

qPCR 技術由于操作過程在封閉體系中進行,降低了污染概率,并且可以通過對熒光信號監測從而進行定量檢測,因此臨床應用最為廣泛,已成為PCR中的主導技術。

實時熒光定量PCR所使用的熒光物質可分為:TaqMan熒光探針、分子信標和熒光染料。

1)TaqMan熒光探針:

PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。

探針完整時,報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收;PCR擴增時,Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監測系統可接收到熒光信號,即每擴增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實現了熒光信號的累積與PCR產物形成全同步。

2)SYBR熒光染料:

在PCR反應體系中,加入過量SYBR熒光染料,SYBR熒光染料非特異性地摻入DNA雙鏈后,發射熒光信號,而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信號,從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加全同步。SYBR僅與雙鏈DNA進行結合,因此可以通過溶解曲線,確定PCR反應是否特異。

3)分子信標

是一種在5和3末端自身形成一個8個堿基左右的發夾結構的莖環雙標記寡核苷酸探針,兩端的核酸序列互補配對,導致熒光基團與淬滅基團緊緊靠近,不會產生熒光。

PCR產物生成后,退火過程中,分子信標中間部分與特定DNA序列配對,熒光基因與淬滅基因分離產生熒光。

第二代PCR主要缺點:

靈敏度還有欠缺,低拷貝標本檢測不準確。

存在背景值影響,結果易受干擾。

當反應體系中有PCR抑制物時,檢測結果易受干擾。

第三代數字PCR

數字PCR(DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR)通過終點檢測計算目標序列的拷貝數,無需采用內參和標準曲線即可進行精確的絕對定量檢測。

數字PCR采用終點檢測,不依賴于Ct值(循環閾值),所以數字PCR反應受擴增效率的影響降低,對PCR反應抑制物的耐受能力提高,具有很高的準確度和重現性。

由于具備高靈敏度、高精確度的特點,不易被PCR反應抑制劑干擾,無需標準品可實現真正意義的絕對定量,而成為研究和應用熱點。

根據反應單元的不同形式,主要可分為微流體式、芯片式和微滴式三大類系統。

1)微流體數字PCR,Microfluidic digital PCR,mdPCR。

基于微流控技術,對DNA模板進行分液,微流控技術能實現樣品納升級或更小液滴的生成,但液滴需要特殊吸附方式再與PCR反應體系結合,mdPCR已逐漸被其他方式取代。

2)微滴數字PCR,Droplet-based digital PCR,ddPCR。

利用油包水微滴生成技術對樣品進行微滴化處理,將含有核酸分子的反應體系分成成千上萬個納升級的微滴,其中每個微滴或不含待檢核酸靶分子,或者含有一個至數個待檢核酸靶分子。

第三代PCR主要缺點:

儀器和試劑昂貴。

模板質量要求較高,模板量超過微體系量將導致無法定量,過少則定量準確度降低。

當存在非特異性擴增時也會產生假陽性。

PCR的各種延伸技術

1.遞減PCR(touchdown PCR):前幾循環溫度逐漸下降。

2.逆轉錄PCR(RT-PCR):以由mRNA逆轉錄而來的cDNA 為模板,也因為是從表現型基因來進行增量的,由此產生出來的cDNA 產物不帶有內含子(基因中不具意義的段落),常應用于分子克隆技術。

3.熱啟動PCR(hotstart PCR):以高熱激活型核酸聚合酶進行反應,減少非專一性產物。

4.巢式PCR(nested PCR):先用低特異性引物擴增幾個循環以增加模板數量,再用高特異性引物擴增。

5.多重PCR(multiplex PCR):在同一個管中使用多組引物。

6.復原條件PCR(reconditioning PCR):PCR 產物稀釋 10 倍后重新放入原濃度的引物和dNTP 等循環 3 次,以消除產物中的異二聚體。

7.dsRNA 合成(dsRNA replicator):合并使用high-fidelity DNA polymersae、T7RNA聚合酶與Phi6 RNA replicase;從雙股 DNA轉錄為對應的雙股RNA(dsRNA)。可應用于RNAi實驗操作。

8.COLD-PCR (co-amplification at lower denaturation temperature PCR):用以檢測突變或特殊等位基因的PCR 應用技術。


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