PCR程序設(shè)置和什么有關(guān)？影響大么？

一旦確定了合適的DNA起始量和PCR組分，就必須設(shè)定PCR循環(huán)和運(yùn)行參數(shù)，從而確保高效擴(kuò)增。

DNA聚合酶的特點(diǎn)、PCR緩沖液的類(lèi)型、模板DNA的復(fù)雜程度都會(huì)影響反應(yīng)條件的設(shè)置。

1、起始高溫變性步驟

在PCR起始階段，通常是在94–98℃下孵育1-3min將雙鏈DNA模板解離成單鏈，從而使引物可與目標(biāo)區(qū)域結(jié)合并開(kāi)始延伸。

此步的高溫條件使起始DNA變性，確保在第一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)期間實(shí)現(xiàn)有效的目標(biāo)序列擴(kuò)增，此外也有助于使樣品中可能存在的熱不穩(wěn)定性蛋白酶或核酸酶失活，從而保證它們極小影響熱穩(wěn)定性DNA聚合酶。

同時(shí)，當(dāng)使用熱啟動(dòng)DNA聚合酶時(shí)，此步同時(shí)可以激活該聚合酶。

起始變性步驟，該步驟的時(shí)間和溫度取決于模板DNA的性質(zhì)和緩沖液的鹽濃度。

例如，哺乳動(dòng)物基因組DNA可能比質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物需要更長(zhǎng)的孵育時(shí)間（具體取決于DNA的復(fù)雜程度和大小）。

同樣，高GC含量（如， >65%）的DNA通常需要更長(zhǎng)的孵育時(shí)間或更高的溫度。高鹽濃度的緩沖液（滿足某些DNA聚合酶的需要）同樣需要更高的變性溫度（如，98℃），以使雙鏈DNA解離。

在95℃以上長(zhǎng)時(shí)間孵育，很容易使Taq DNA聚合酶等DNA聚合酶變性。為彌補(bǔ)在該步驟中酶損失的活性，可能需要在起始變性步驟后添加更多的酶，或在一開(kāi)始加入多于建議用量的DNA聚合酶。高度熱穩(wěn)定的酶(如來(lái)自Archaea的酶)能夠耐受長(zhǎng)時(shí)間高溫孵育，在整個(gè)PCR過(guò)程中保持活性。

2、循環(huán)變性步驟

起始變性步驟后，后續(xù)PCR循環(huán)以一個(gè)獨(dú)立的變性步驟開(kāi)始，并在94–98℃條件下持續(xù)0.5-2min。

與起始模板DNA變性步驟一樣，該步驟的時(shí)間和溫度也可根據(jù)模板DNA、DNA聚合酶和緩沖液成分的性質(zhì)進(jìn)行優(yōu)化。

例如，更長(zhǎng)時(shí)間和/或高溫條件對(duì)長(zhǎng)片段和/或富含GC的目的片段可能是有利的。

甘油、DMSO、甲酰胺和甜菜堿等添加劑的存在，可促進(jìn)變性步驟期間雙鏈DNA的解離并提高特異性，從而無(wú)需長(zhǎng)時(shí)間或高溫條件。

3、引物退火步驟

在該步驟中，目的是降低反應(yīng)溫度，使引物與目標(biāo)DNA結(jié)合。

通常，0.5-2min的孵育時(shí)間足以供引物完成退火。通過(guò)計(jì)算PCR擴(kuò)增引物的熔解溫度（Tm），可確定退火溫度。根據(jù)一般經(jīng)驗(yàn)法則，起始退火溫度比引物低至Tm低3–5℃。

Tm指50%的引物與其互補(bǔ)序列形成雙鏈時(shí)的溫度，可通過(guò)多種方法進(jìn)行計(jì)算。引物Tm估算簡(jiǎn)單的方法是利用DNA寡核苷酸中的核苷酸數(shù)量進(jìn)行計(jì)算，公式如下：Tm = 4 (G + C) + 2 (A + T)。

由于反應(yīng)的鹽濃度 (Na?) 會(huì)影響引物退火，因此，使用以下公式能夠更加準(zhǔn)確地計(jì)算Tm：Tm=81.5+16.6(log[Na?]) + 0.41(%GC)–675/引物長(zhǎng)度。

Tm計(jì)算需考慮的一個(gè)重要因素是PCR添加劑、輔助溶劑和修飾核苷酸的使用。這些試劑的存在會(huì)降低引物-模板復(fù)合物的Tm。

例如，10%DMSO會(huì)使退火溫度降低5.5–6.0℃。同樣，在PCR中使用7-deaza-dGTP取代dGTP也會(huì)降低Tm。此時(shí)，應(yīng)相應(yīng)調(diào)整退火溫度。

7-Deaza-dGTP是一種人工合成的dGTP類(lèi)似物，可作為大多數(shù)DNA聚合酶(包括Taq DNA Polymerase)的底物。

與dGTP相比，7-Deaza-dGTP具有更高的電子親和力化學(xué)穩(wěn)定性，這使得它在DNA合成反應(yīng)中更容易被酶識(shí)別和嵌入，從而提高了DNA合成的效率和準(zhǔn)確性。7-Deaza-dGTP摻入DNA后可影響DNA的熒光染色和電泳遷移率；與dITP相比，7-Deaza-dGTP提升了長(zhǎng)序列區(qū)域的易讀性。

7-Deaza-dGTP替代或部分替代dGTP擴(kuò)增富含GC的DNA序列，可提升有效降低PCR反應(yīng)錯(cuò)誤率，提高PCR產(chǎn)物產(chǎn)量，使DNA測(cè)序更加簡(jiǎn)單高效，廣泛應(yīng)用于富含GC的DNA序列的PCR擴(kuò)增、測(cè)序和基因克隆等生物實(shí)驗(yàn)，在疾病診斷中發(fā)揮重要作用。

應(yīng)注意，計(jì)算所得 Tm 值就是引物退火的起始參考溫度。退火溫度可能需要根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

例如，如果結(jié)果為無(wú)擴(kuò)增條帶或擴(kuò)增水平很低，則優(yōu)化時(shí)應(yīng)以2–3℃增量逐漸降低退火溫度。但是，如果出現(xiàn)非特異性PCR產(chǎn)物，則以2–3℃增量逐漸提高溫度（最高至延伸溫度），提高特異性。

4、引物延伸步驟

引物退火后，便是延伸引物的3'末端，產(chǎn)生模板的互補(bǔ)鏈。該步中，DNA聚合酶的5'→ 3'聚合酶活性引入dNTP并合成子鏈。

反應(yīng)溫度升高至酶的最佳溫度（熱穩(wěn)定DNA聚合酶的最佳溫度通常為70–75℃），使其達(dá)到最高活性。

如果引物退火溫度與延伸溫度相差不超過(guò)3℃，則退火和延伸溫度可合并為一步，稱(chēng)為兩步PCR法。兩步PCR法無(wú)需在退火和延伸之間轉(zhuǎn)換和穩(wěn)定溫度，從而縮短了PCR所需的時(shí)間。

PCR的延伸時(shí)間取決于DNA聚合酶的合成速度以及目標(biāo)DNA的長(zhǎng)度。

Taq DNA聚合酶的一般延伸時(shí)間是1min/kb，而 Pfu DNA聚合酶為2min/kb。因此，“緩慢型”聚合酶比“快速型”聚合酶需要更多的擴(kuò)增時(shí)間，才能獲得相等的得率。

同樣，長(zhǎng)DNA擴(kuò)增子比短DNA需要更長(zhǎng)的延伸時(shí)間，才能實(shí)現(xiàn)全長(zhǎng)復(fù)制。當(dāng)擴(kuò)增長(zhǎng)目的片段（如， >10 kb）時(shí)，除了需要增加延伸時(shí)間，還需要降低PCR溫度，以確保引物結(jié)合并在長(zhǎng)時(shí)間循環(huán)中維持酶活性。

5、PCR循環(huán)數(shù)設(shè)置

為擴(kuò)增目標(biāo)DNA，需重復(fù)PCR的變性、退火和延伸步驟多次。循環(huán)數(shù)通常為25-35次，具體取決于DNA起始量和所需的目標(biāo)PCR產(chǎn)物得率。

如果DNA起始量少于10拷貝數(shù)，則可能需要多達(dá)40個(gè)循環(huán)，才可獲得足夠的得率。不建議使用超過(guò)45個(gè)循環(huán)，因?yàn)檫^(guò)多的循環(huán)數(shù)會(huì)產(chǎn)生非特異性條帶。而且，副產(chǎn)物的累積和反應(yīng)組分的消耗會(huì)大大降低PCR效率，使PCR擴(kuò)增曲線出現(xiàn)平臺(tái)期。

相反，較少的循環(huán)數(shù)更適合于無(wú)偏倚擴(kuò)增（如下一代測(cè)序）以及目標(biāo)DNA的準(zhǔn)確復(fù)制（如克隆）。

6、最終延伸步驟

最后一個(gè)PCR循環(huán)完成后，即為最終延伸步驟。該步中，將PCR混合物在延伸溫度（通常為72℃）下最后孵育5-15min。其持續(xù)時(shí)間取決于擴(kuò)增子長(zhǎng)度和組成，以確保全長(zhǎng)復(fù)制以及高目標(biāo)DNA片段得率。

在該步驟中，除了填補(bǔ)不完整末端外，Taq DNA 聚合酶等具有末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）活性的DNA聚合酶還會(huì)在PCR引物的3'末端添加額外的核苷酸。

因此，如果PCR擴(kuò)增子被克隆到TA載體中，建議最終的延伸步驟持續(xù)30min，以確保生成合適的3'-dA尾部結(jié)構(gòu)以實(shí)現(xiàn)有效的PCR克隆。

參考文獻(xiàn)：

［1］PCR循環(huán)參數(shù)—成功的六大關(guān)鍵因素-賽默飛

［2］7-Deaza-dGTP (10mM, for GC-Rich PCR/Sequencing)-碧云天

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