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PCR技術操作流程

來源:上海雅吉生物科技有限公司   2024年11月20日 08:49  

PCR技術操作流程

一、PCR 的基本原理


類似于 DNA 的體內復制。首先待擴增 DNA 模板加熱變性解鏈,隨之將反應混合物冷卻至某一溫度,這一溫度可使引物與它的靶序列發生退火,再將溫度升高使退火引物在 DNA 聚合酶作用下得以延伸。這種熱變性 - 復性 - 延伸的過程就是一個 PCR 循環,PCR 就是在合適條件下的這種循環的不斷重復。


二、PCR 反應體系


1. 緩沖液

標準的緩沖液含 1pmol/ml Tris ·HCl,其 pH 為 8.3-9.0(室溫),而在延伸溫度(72 ℃)下,pH 值接近 7.2 。緩沖液中含有一種二價陽離子,用于激活 DNA 聚合酶的活性中心,一般使用 Mg2+。


2.dNTP

脫氧核糖核苷三磷酸的縮寫,是包括 dATP, dGTP, dTTP, dCTP 等在內的統稱,即合成新的 DNA 鏈的材料。4 種 dNTP 的濃度相等,總濃度一般為 200pmol/ml (即飽和濃度)。dNTP 可與 Mg2+ 結合,使游離的 Mg2+ 濃度下降,影響 DNA 聚合酶的活性。


3. 引物

引物是一段短的單鏈 DNA 片段,可結合在核酸鏈上與之互補的區域,其功能是作為核苷酸聚合作用的起始點,DNA 聚合酶可由其 3′端開始合成新的核酸鏈。引物長度一般以 18~30bp 為宜,過短則降低特異性,過長則會引起引物間的退火而影響有效擴增,同時也增加引物合成的成本。引物的堿基順序不能與非擴增區有同源性。


4. 模板

模板是一段單鏈或者雙鏈 DNA,提供用于進行 PCR 擴增的原始信息。對模板的純度要求低,但不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA 聚合酶抑制劑、DNA 結合蛋白等。模板 DNA 應該盡量保持低溫保存。


5.Taq DNA 聚合酶

Taq DNA 聚合酶以 DNA 為復制模板,從將 DNA 由 5' 端點開始復制到 3' 端的酶。DNA 聚合酶的主要活性是催化 DNA 的合成(在具備模板、引物、dNTP 等的情況下)及其相輔的活性。必須一直保存于-20℃,內含甘油保存。最適反應溫度 72 ℃,即延伸溫度。通常在配制 PCR 體系的最后加入。


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