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Na+K+- ATP 酶活性檢測試劑盒（可見分光光度法）

來源：上海尚寶生物科技有限公司 2024年11月25日 11:30

Na⁺K⁺- ATP 酶活性檢測試劑盒（可見分光光度法）

產(chǎn)品貨號：BA1037

產(chǎn)品規(guī)格：50管/24樣

產(chǎn)品內(nèi)容：

試劑一：液體30mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體4mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×2支，-20℃保存。臨用前用1mL蒸餾水溶解，現(xiàn)用現(xiàn)配。用不完的試劑-20℃可保存一周。

試劑四：液體2mL×1瓶，4℃保存。

試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存。用時加入3mL雙蒸水， 4℃保存。

試劑六：粉劑×1瓶, 4℃保存。用時加入15mL雙蒸水，溶解后4℃保存一周。

試劑七：粉劑×1瓶, 4℃保存。用時加入15mL雙蒸水，溶解后4℃保存一周。

試劑八：液體15mL×1瓶，室溫保存。

標準品：10μmol/mL標準磷貯備液1mL×1支，4℃保存。

0.5μmol/mL 標準磷應用液配制：將標準品20倍稀釋，即取0.1mL標準品加1.9mL蒸餾水充分混勻。

定磷劑的配制：按H2O:試劑六:試劑七:試劑八=2:1:1:1的比例配制，配好的定磷劑應為淺黃色。若無色則試劑失效，若是藍色則為磷污染，定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。

注意：配試劑最好用新的燒杯、玻璃棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。

產(chǎn)品說明：

Na⁺K⁺- ATP 酶廣泛分布于植物、動物、微生物和細胞中，可催化ATP水解生成ADP和無機磷。

Na⁺K⁺-ATP 酶分解ATP生成ADP及無機磷，通過測定無機磷的量來確定ATP酶活性。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣品酶液的制備：

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每500萬細菌或細胞加入1mL試劑一，超聲波破碎細菌或細胞（功率20％，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

二、測定步驟

1、可見分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至660nm，蒸餾水調(diào)零。

2、酶促反應（在EP管中加入下列試劑）

	對照管	測定管
試劑一（μL）	130	90
試劑二（μL）	80	80
試劑三（μL）	40	40
試劑四（μL）		40
樣品（μL）		200
混勻，37℃（哺乳動物）或25℃（其他物種）準確水浴10min
試劑五（μL）	50	50
樣品（μL）	200
混勻，4000g，常溫離心10min，取上清液

3 定磷

	空白管	標準管	對照管	測定管
0.5μmol/ml標準磷應用液（μL）		100
上清液（μL）			100	100
蒸餾水（μL）	100
定磷試劑（μL）	1000	1000	1000	1000
混勻，40℃水浴10min，在660nm處，記錄各管吸光值。

三、計算

1、血清（漿）Na⁺K⁺-ATPase活力的計算：

定義：規(guī)定每小時每毫升血清（漿）中Na⁺K⁺- ATP酶分解ATP產(chǎn)生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。

Na⁺K⁺-ATP 酶活力（U/mL）= C標準管×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）×V總÷V樣÷T

=7.5×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）

2、組織、細菌或細胞中Na⁺K⁺- ATPase活力的計算：

（1）按蛋白濃度計算：

定義：規(guī)定每小時每毫克組織蛋白中Na⁺K⁺- ATP酶分解ATP產(chǎn)生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。

Na⁺K⁺-ATP 酶活力(U/mg prot)= C標準管×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）×V總÷（Cpr×V樣）÷T =7.5×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

定義：規(guī)定每小時每克組織中Na⁺K⁺-ATP酶分解ATP產(chǎn)生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。

Na⁺K⁺-ATP 酶活力(U/g鮮重)= C標準管×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）×V總÷(V樣÷V樣總×W)÷T=7.5×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

定義：規(guī)定每小時每1萬個細菌或細胞中Na⁺K⁺-ATP酶分解ATP產(chǎn)生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。

Na⁺K⁺-ATP 酶活力(U/10⁴)= C標準管×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）×V總÷(V樣÷V樣總×500)÷T=0.015×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）

C標準管：標準管濃度，0.5μmol/mL；V總：酶促反應總體積，0.5mL；V樣：加入樣本體積，0.2mL ；V樣總：加入試劑一體積，1mL；T：反應時間，1/6小時；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。

注意事項：

1、由于每一個樣都必須做對照，本試劑盒50管保證測24份Na⁺K⁺-ATP酶。

2、此法具有微量、靈敏、快速的特點。所以對測定所用試管要求嚴格無磷。

3、空白管和標準管各只要做一管。