1+1＞2|IL - 12/18協(xié)同賦能，驅(qū)動(dòng)NK細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)新進(jìn)程

一、NK細(xì)胞的重要性與應(yīng)用前景

NK 細(xì)胞作為人體重要的免疫細(xì)胞，在抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在抗腫瘤方面，NK 細(xì)胞具有直接殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，是機(jī)體抗腫瘤的一道防線(xiàn)。例如，在肝癌治療中，提高 NK 細(xì)胞活性有助于預(yù)防肝癌復(fù)發(fā)，改善患者預(yù)后。上海市公共衛(wèi)生臨床中心對(duì)10例肝惡性腫瘤患者進(jìn)行 NK 細(xì)胞過(guò)繼回輸治療，結(jié)果顯示該療法在提高患者短期生活質(zhì)量、改善臨床癥狀方面具有顯著效果。在抗病毒感染方面，NK 細(xì)胞在機(jī)體受到病毒感染時(shí)，不需要抗原刺激，就可以產(chǎn)生細(xì)胞因子、白細(xì)胞介素和干擾素等，對(duì)抗腫瘤的發(fā)生和病毒感染。在免疫調(diào)節(jié)方面，NK 細(xì)胞能夠調(diào)解人體免疫功能，防止產(chǎn)生自身免疫性疾病以及其他免疫功能的異常。臨床上可通過(guò)檢測(cè)NK細(xì)胞的功能，了解病人的免疫狀態(tài)，從而判斷患者是否患有免疫功能低下、免疫功能亢進(jìn)以及免疫增殖病等疾病。

NK 細(xì)胞在臨床應(yīng)用中具有廣闊的前景。例如，在晚期實(shí)體瘤治療方面，CEL001 注射液作為申請(qǐng)并通過(guò)CDE審評(píng)批準(zhǔn)的非基因修飾同種異體 NK 細(xì)胞候選產(chǎn)品，為晚期實(shí)體瘤患者帶來(lái)了新的治療選擇。該產(chǎn)品在結(jié)直腸癌的動(dòng)物模型中展現(xiàn)出強(qiáng)大的抗腫瘤活性，并能有效克服結(jié)直腸癌異質(zhì)性難題。此外，NK細(xì)胞療法還能配合放化療，有效清除手術(shù)不能切除的腫瘤細(xì)胞，提高放化療的療效，并降低副作用。對(duì)于不適合做手術(shù)或放化療的晚期癌癥患者來(lái)說(shuō)，讓 NK 細(xì)胞恢復(fù)到高水準(zhǔn)的活性和數(shù)量是一個(gè)較好的選擇。術(shù)后定期采用 NK 細(xì)胞治療還可以預(yù)防癌癥的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，減緩癌性疼痛，改善睡眠，提高患者生命質(zhì)量，并延長(zhǎng)患者的生命周期。

二、IL-12 和 IL-18 對(duì) NK 細(xì)胞的作用機(jī)制

（一）協(xié)同激活 NK 細(xì)胞

IL-18 和 IL-12 聯(lián)合刺激對(duì) NK 細(xì)胞的活化具有強(qiáng)大的協(xié)同作用。白細(xì)胞介素 (IL)-18 和 IL-12 都是抗原呈遞細(xì)胞響應(yīng)刺激信號(hào)而分泌的細(xì)胞因子，在增強(qiáng) NK 細(xì)胞活性、IFN-γ產(chǎn)生和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)方面都發(fā)揮著關(guān)鍵作用。已有研究證明，IL-18 是啟動(dòng) NK 細(xì)胞以響應(yīng) IL-12 產(chǎn)生IFN-γ所必需的。與單獨(dú)使用IL-18 或 IL-12 的刺激相比，使用 IL-18+IL-12 的刺激可以誘導(dǎo)更大的NK 細(xì)胞脫粒和IFN-γ產(chǎn)生。

（二）促進(jìn)細(xì)胞因子產(chǎn)生

IL-18 和 IL-12 能促進(jìn)NK細(xì)胞產(chǎn)生IL-8等細(xì)胞因子。IL-8是一種趨化因子，在宿主對(duì)感染的反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，同時(shí)也具有多種促腫瘤功能。相關(guān)文獻(xiàn)揭示，IL-18+IL-12 刺激在多種情況下有效誘導(dǎo)原代人 NK 細(xì)胞產(chǎn)生IL-8。研究表明，由 NK 細(xì)胞響應(yīng) IL-18+IL-12 刺激分泌的 TNF-α作為中間體進(jìn)一步促進(jìn) NK 細(xì)胞產(chǎn)生 IL-8。IFN-γ和TNF-α在IL-18+IL-12 刺激后在 NK 細(xì)胞中的表達(dá)均呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，其中TNF-α在 IL-8之前產(chǎn)生，且被中和后顯著抑制了 IL-8 的產(chǎn)生，表明 TNF-α通過(guò)自分泌的方式對(duì) IL-18+IL-12 誘導(dǎo) NK 細(xì)胞產(chǎn)生 IL-8 的協(xié)同作用發(fā)揮中間作用。同時(shí)，NK 細(xì)胞產(chǎn)生的 IL-8 以自分泌或旁分泌的方式進(jìn)一步加強(qiáng)了 IL-18+IL-12 刺激的 NK 細(xì)胞的細(xì)胞因子反應(yīng)。此外，已知的 NK 細(xì)胞激活劑和存活因子 IL-15 和 IL-2 也已被證明與 IL-18 和 IL-12 具有協(xié)同作用，即 IL-2 和 IL-15 均可以增加 IL-18+IL-12 刺激 NK 細(xì)胞產(chǎn)生 IL-8 的協(xié)同作用。

三、IL-12 IL-18 聯(lián)合培養(yǎng) NK 細(xì)胞的方法

（一）細(xì)胞因子誘導(dǎo)增殖

細(xì)胞因子在體外擴(kuò)增 NK 細(xì)胞的過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。研究表明，IL-12、IL-15和IL-18聯(lián)合作用能夠誘導(dǎo)出細(xì)胞因子誘導(dǎo)的記憶樣NK細(xì)胞（CIML NK細(xì)胞）。這種CIML NK細(xì)胞具有諸多顯著特點(diǎn)，如壽命長(zhǎng)，能夠在體內(nèi)持續(xù)發(fā)揮作用；細(xì)胞毒性高，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有強(qiáng)大的殺傷能力；同時(shí)還能分泌大量的 IFN-γ，增強(qiáng)抗腫瘤反應(yīng)。

據(jù)資料顯示，CIML NK 細(xì)胞關(guān)鍵表型特征包括CD25（IL-2Ra）表達(dá)增加，KIRs表達(dá)減少，以及TGFβ受體表達(dá)減少，這有助于釋放CIML-NK細(xì)胞的抑制作用。此外，SEMA7A 表達(dá)上調(diào)，增加IFNγ的產(chǎn)生可能有助于增強(qiáng)抗腫瘤反應(yīng)，CpG去甲基化等表觀遺傳變化也已被報(bào)道。同時(shí)，CIML NK細(xì)胞氧化磷酸化（OXPHOS）升高和糖酵解值升高，鐵蛋白受體（CD71）、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（CD98）和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體（GLUT1 和 GLUT3）在內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)增加，這些特性在其長(zhǎng)期持久性和回憶功能中起著重要作用。

（二）輔助細(xì)胞協(xié)助擴(kuò)增

輔助細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞在NK細(xì)胞擴(kuò)增中發(fā)揮著重要作用。NK細(xì)胞與自體非 NK細(xì)胞或生長(zhǎng)失活的滋養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)，可以顯著影響NK細(xì)胞的活化和擴(kuò)增。例如，有研究構(gòu)建了表達(dá)多種效應(yīng)分子的滋養(yǎng)細(xì)胞，如同時(shí)表達(dá)CD137L、CD48、mIL-15和mIL-21的滋養(yǎng)層細(xì)胞，能夠極大地提高NK細(xì)胞的擴(kuò)增數(shù)目和純度，并且擴(kuò)增得到的NK細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒作用。

此外，還有通過(guò)構(gòu)建慢病毒質(zhì)粒制備滋養(yǎng)細(xì)胞的方法。如構(gòu)建用T2A連接的 CD86和CD137L的序列和帶有嘌呤霉素抗性的慢病毒質(zhì)粒，將其包裝后感染k562 細(xì)胞，篩選出具有抗性的k562-CD86-CD137L細(xì)胞，再用顯示綠色熒光的慢病毒質(zhì)粒感染，分選出具有綠色熒光標(biāo)志的細(xì)胞，即為滋養(yǎng)細(xì)胞。這種滋養(yǎng)細(xì)胞在NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液中共培育外周血單核細(xì)胞，每周重復(fù)刺激，可獲得足夠量的 NK細(xì)胞。這些方法都為 NK 細(xì)胞的擴(kuò)增提供了新的途徑和思路，有望在臨床治療中發(fā)揮更大的作用。

NK細(xì)胞培養(yǎng)關(guān)鍵細(xì)胞因子

逐典生物推出多種NK細(xì)胞培養(yǎng)關(guān)鍵白介素家族類(lèi)細(xì)胞因子，經(jīng)ELISA驗(yàn)證具備高生物活性，經(jīng)SDS-PAGE與SEC-HPLC驗(yàn)證具有高純度和高結(jié)構(gòu)均一性，產(chǎn)品齊全，質(zhì)控嚴(yán)格，確保強(qiáng)特異性、高靈敏度、高穩(wěn)定性及良好的重復(fù)性，適用于腫瘤免疫、藥物靶點(diǎn)篩選及表征，全面助力生物藥研發(fā)及上市進(jìn)程。

1. IL-2 Pro(CY017F0100)
   

Figure1.IL-2 Pro同野生型IL-2活性比較

1. IL-15 Pro（CY018F0100）
   

Figure2.IL-15 Pro同野生型IL-15活性比較

1. IL-12(CY071F0010)
   IL-12 Standard
   Chaselection
   Brand A
   

Figure3.Recombinant Human IL-21 stimulates proliferation of T cell

1. IL-18(CY044F0010)
   

Figure4.Recombinant Human IL-21 stimulates proliferation of KG-1 cell

1. IL-21(CY025F0010)

Chaselection

Brand R

Figure5.Recombinant Human IL-21 stimulates proliferation of NK-92 cell

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