賽默飛熒光定量PCR儀的工作原理

賽默飛熒光定量PCR儀（Thermo Fisher Scientific Real-Time PCR Systems）是基于聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction, PCR）技術的熒光定量檢測設備，其核心原理是通過實時監測熒光信號的變化來定量分析核酸擴增過程，揭示目標DNA或RNA的起始量。以下是賽默飛熒光定量PCR儀的詳細工作原理：

1. 基本工作流程

賽默飛熒光定量PCR儀的工作流程可以分為以下幾個階段：

(1) 樣本準備

• 提取核酸：目標DNA或RNA從細胞、組織或其他樣本中提取。

• 反轉錄（對于RNA樣本）：使用逆轉錄酶將RNA轉錄為cDNA。

(2) PCR反應設置

• 反應體系：PCR混合液包括模板核酸、引物、探針或熒光染料、dNTP、Taq DNA聚合酶及緩沖液。

• PCR試劑：

• 使用特定熒光標記的探針（如TaqMan探針）或熒光染料（如SYBR Green）以實時監測擴增反應。

(3) PCR循環

PCR反應在熱循環系統中分為以下三個步驟，循環30-40次：

1. 變性：高溫（通常為95℃）使雙鏈DNA分離為單鏈。

2. 退火：降低溫度（通常為55-65℃），引物與模板DNA結合。

3. 延伸：通過Taq DNA聚合酶在72℃合成新鏈。

(4) 熒光信號檢測

• 賽默飛熒光定量PCR儀內置的光學檢測系統實時監測每個PCR循環中的熒光信號變化。

• 熒光強度與目標核酸的擴增量成正比。

2. 熒光定量PCR的關鍵技術

(1) 熒光信號產生與檢測

賽默飛熒光定量PCR儀使用熒光探針或染料標記擴增反應的產物，具體技術包括：

1. TaqMan探針法

• 探針是一段帶有熒光標記和猝滅基團的寡核苷酸。

• 工作原理：

• 在PCR延伸階段，Taq DNA聚合酶的5'-3'外切酶活性將探針降解，釋放熒光基團，使熒光信號得以監測。

• 熒光強度與擴增產物數量呈線性相關。

2. SYBR Green染料法

• SYBR Green是一種嵌入雙鏈DNA的熒光染料。

• 工作原理：

• 隨著PCR反應中雙鏈DNA的生成，SYBR Green嵌入其中，產生熒光信號。

• 熒光強度的增加反映擴增產物的累積量。

3. 高分辨率熔解曲線分析（HRM）

• HRM技術通過監測DNA解鏈時的熒光信號變化，用于檢測單核苷酸多態性（SNP）和突變分析。

(2) 定量方法

賽默飛熒光定量PCR儀通過以下兩種方式實現核酸的絕對定量或相對定量分析：

1. 絕對定量

• 使用標準曲線，通過已知濃度標準品的熒光信號，計算未知樣本中核酸的起始量。

2. 相對定量

• 通過參考基因的表達量對目標基因進行標準化分析，適合基因表達研究。

(3) 光學檢測系統

• 賽默飛熒光定量PCR儀配備多色光學檢測系統：

• 使用LED光源激發熒光。

• CCD相機或光電二極管陣列捕獲熒光信號。

• 系統實時采集熒光信號并進行數據分析。

3. 數據分析與結果輸出

賽默飛熒光定量PCR儀通過內置的軟件平臺對熒光信號進行分析，主要步驟包括：

(1) 閾值循環數（Ct值）

• Ct值是熒光信號達到設定閾值時的PCR循環數。

• Ct值越低，模板起始量越高。

(2) 標準曲線分析

• 通過繪制標準曲線，計算未知樣本的絕對濃度。

(3) 熔解曲線

• 熔解曲線用于驗證PCR擴增的特異性，單一峰值表明反應特異性好，多峰值可能提示非特異擴增或引物二聚體。

(4) 定量結果展示

• 數據可通過曲線圖、柱狀圖等形式直觀展示，便于分析。

4. 賽默飛熒光定量PCR儀的優化設計

1. 高靈敏光學檢測

• 多通道熒光檢測系統可同時監測多個靶標，確保實驗靈活性和高效性。

2. 快速熱循環系統

• 賽默飛儀器通過精準的溫度控制系統，加速PCR反應，縮短實驗時間。

3. 智能化軟件平臺

• 支持自動分析Ct值、熔解曲線，簡化數據處理流程。

• 云端連接功能，支持遠程實驗管理和數據共享。

4. 兼容性與靈活性

• 支持96孔、384孔板和TaqMan Array卡等多種平臺。

• 靈活適配不同熒光染料和探針。

5. 賽默飛熒光定量PCR儀的優勢

• 靈敏度高：精確檢測低豐度模板。

• 多通道檢測：最多支持8色熒光檢測，適合多重實驗。

• 實驗效率高：快速模式大幅縮短反應時間。

• 特異性強：采用TaqMan探針，避免非特異性擴增影響結果。

• 便捷操作：直觀界面設計，支持自動化運行。

6. 應用領域

1. 基因表達分析

• 精確定量基因表達變化，用于研究基因調控機制。

2. 病原體檢測

• 快速、準確檢測病毒和細菌，核酸檢測。

3. 遺傳突變分析

• 檢測SNP和點突變，適合癌癥研究和遺傳性疾病篩查。

4. 藥物篩選

• 高通量基因表達分析，為新藥開發提供支持。

5. 分子診斷

• 應用于個性化醫療，通過實時檢測提供臨床診斷依據。

總結

賽默飛熒光定量PCR儀通過先進的光學檢測系統、靈敏的熒光探針技術和高效的反應體系，確保實驗數據的精確性與可靠性。其工作原理結合TaqMan探針法和SYBR Green染料法，支持多種定量檢測需求。同時，智能化操作和多樣化適配平臺使其廣泛應用于科研和臨床領域，為分子生物學研究提供強有力的技術支持。