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使用多功能多通道的 PurePep Chorus 對 PNA 合成條件進行快速優化
肽核酸(簡稱 PNA )是具有類多肽骨架的 DNA 類似物，且具有多種物理化學性質。PNA 的主鏈骨架是由 N(2-氨基乙基)-甘氨酸與核酸堿基通過亞甲基羰基連接而成的。
圖1：肽核酸的結構示意圖，及與 DNA 鍵合
肽核酸非離子核酸類似物，由于 PNA 不帶負電荷，與 DNA 和 RNA 之間不存在靜電斥力，因而結合的穩定性和特異性都大為提高，與 DNA 或 RNA 分子的雜交能力遠優于 DNA/DNA 或 DNA/RNA，表現在很高的雜交穩定性、優良的特異序列識別能力、不被核酸酶和蛋白酶水解。
PNAs可以通過 RNAs 結合互補從而抑制基因表達。并且在特定的條件下，也可以通過鏈入侵機制與 DNA 雙鏈序列結合來促進基因表達。基于以上優勢特點，近十年來 PNA 被廣泛用于多個領域，高親和力和特異性使它們不僅成為治療劑，而且在診斷的應用中也成為有力的工具。
隨著 PNA 基礎研究的不斷深入和新技術的不斷出現，PNA 將顯示出更好的性能和更為廣闊的應用前景。
目前的挑戰
由于合成過程中容易發生聚合，且脫保護過程中有很多副反應，PNAs 的合成具有較大的挑戰。針對容易聚合的問題，通常的策略是在縮合反應中使用過量的試劑。但是，用于合成的 N 端保護的 PNA 單體試劑價格相對較高，該方法沒有得到廣泛應用。因此，必須開發出相對經濟高效的合成工藝才能幫助PNAs 成功實現商業化。
在 PurePep Chorus 上進行合成條件的優化
在本文中，我們將展示在 PurePep Chorus 自動合成儀上實現對 PNA 的合成條件的的快速優化。
PNA 1 將用于參考序列以考察不同的合成參數，如 PNA 單體的過量系數、反應時間以及溫度。合成出 PNA 1 純度最高的條件將被用于合成其他5條長度及嘌呤(腺嘌呤及鳥嘌呤)含量不同的序列(見表1)。純度是考察合成的一個關鍵因素，由于 PNA 單體的空間位阻大，容易引起縮合反應不完全導致低純度。
表1：此次案例中涉及的 PNA 序列信息
PNA 1 使用 PurePep Chorus 多肽合成儀合成，合成當量為 25 μmol，使用了取代度為 0.27 mmol/g 的 Rink Amide MBHA 樹脂，并遵循 Fmoc/tBu 正交保護方案。樹脂上 Fmoc 基團的脫保護使用20%哌啶 DMF 溶液，在室溫下反應 5分鐘×2 次；縮合反應使用 HCTU 和 NMM 的體系，具體的反應細節見表2。縮合反應結束后執行封端的操作，使用10%醋酸酐 DMF 溶液，室溫下反應5分鐘。最后一步脫保護結束后，將樹脂放在切割液(TFA: TIS: H2O=95: 2.5: 2.5)中，室溫下反應4小時。
以上操作可在 Chorus 上根據所需條件在軟件上設置不同 Protocol，軟件自動計算所需試劑量，儀器自動運行，更大化節省人工操作，并且確保試驗方案被嚴格執行。
表2 縮合條件的研究
從表2 的數據分析我們可以發現當 PNA 的反應當量數為10倍時，產物粗品的純度達到81%；然而基于合成原料 Fmoc-PNA 單體價格高，上述的設計不易被接受。將 PNA 的反應當量系數降低到4倍，產物粗品的純度降低到 72%。此時維持 PNA 的反應當量系數在4倍，將反應溫度升至 45℃ 并減少縮合時間至 5 分鐘，產物粗品的純度進一步下降到 61%。由此可見，對于縮合反應而言5分鐘反應時間太短。此時其他條件不變，單獨將反應時間增加到10分鐘(實驗D)，粗肽純度達到了82%，與實驗A的結果相近。實驗E用于進一步考察反應的條件，反應當量系數調整為2，且做了2次加樣反應。使用了總量相同的反應原料并在相同的縮合時間下，產物粗品的純度提高了5%。
我們根據 PNA 1 產物純度的最高值確定了合成條件，剩下的幾條序列將使用與 PNA 1 相同的方式合成(即方法E)。結果在表3中顯示：
表3：使用方法E合成其余5條 PNA 的粗品結果
上述5條 PNA 合成后產物的粗品純度在66-91%之間，這樣的結果對于肽核酸而言令人滿意。有趣的是，嘌呤含量更高的 PNA 產物擁有更高的純度。
圖2：5條 PNAs 產物用 UPLC-UV 系統在210nm波長下采集的色譜圖。UPLC系統為 Waters H-class UPLC/ESI-MS，色譜柱為C18 (1.7 μm,2.1 x 50 mm) 。流動相為0.1% TFA在水(A)與乙腈(B)混合溶液。
總結
在此應用文獻中，我們詳細討論了使用 PurePep Chorus 系統優化 PNA 合成的方法。最初我們使用了10倍反應當量的 PNA 在室溫下縮合反應1小時，這樣的方法可以獲得純度達到81%的產物粗品。我們致力于降低反應物的用量，并將其對粗品純度的影響降到最低從而讓該反應更加經濟、可持續、更符合綠色化學的要求。最終我們開發出了既減少反應物用量，純度又高的方法。使用2次縮合的方式，每一次加樣用2倍的反應當量，在45℃條件下反應5分鐘，可以將PNA 1的粗品純度從81%提升到87%。最后該方法倍應用到了其他5條 PNA 的合成上。
對于不同長度及不同嘌呤含量的肽核酸，該方法都能得到很不錯的產物。PurePep Chorus 多肽合成儀對該工作是一個很好的工具，因為合成的方案可以根據需要靈活調整；比如修改反應當量系數、重復次數、溫度及時間。同時，自動化的儀器及軟件的自動計算功能幫助減少人工操作，降低失誤風險，優化后的合成條件可以被輕松的應用于其他 PNAs 合成。
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