miR-342-5p downstream to Notch enhances arterialization of endothelial cells in response to shear stress by repressing MYC

Keywords: MT: Non-coding RNAs; Notch; arterialization; endothelial cell; miR-342-5p; shear stress.

血管生成，是指從已有血管發(fā)展形成新的血管，涉及內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）的增殖、分化和遷移。在生長的血管新生芽融合后，內(nèi)皮細(xì)胞獲得動脈表型并進(jìn)一步成熟，最終形成一個穩(wěn)定的分級血管網(wǎng)絡(luò)，通過動脈化的過程灌注組織。

遺傳程序和環(huán)境因素都參與 EC 動脈化，如血流誘導(dǎo)的剪切應(yīng)力、血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR）信號和 Notch 信號。以往研究報(bào)道了 ECs 中 Notch 下游的 miRNAs，發(fā)現(xiàn)激活Notch 信號至少部分通過 miR-218-5p 下調(diào) MYC 基因表達(dá)以抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，靶向異質(zhì)核核糖檢查蛋白A1（HNRNPA1）和眼缺失同源物3（EYA3）。miR-342-5p 是另一種抑制 EC 增殖和血管生成的 Notch 下游 miRNA。研究證明，在 EC 中，miR-342 可以被層流剪切應(yīng)力上調(diào)。然而，剪切應(yīng)力對 miR-342 的上調(diào)是否由 Notch 信號介導(dǎo)，以及 miR-342 在通過 Notch 信號介導(dǎo)機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)以促進(jìn) EC 動脈化中的作用尚不清楚。

鑒于此，空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)院韓驊教授/晏賢春副教授及西京醫(yī)院劉曉渭教授團(tuán)隊(duì)合作在Molecular Therapy Nucleic Acids 期刊發(fā)表了題為“miR-342-5p downstream to Notch enhances arterialization of endothelial cells in response to shear stress by repressing MYC”的研究成果。該研究評估了剪切應(yīng)力、Notch 信號和 miR-342 之間的關(guān)系及其在促進(jìn) EC 動脈化中的下游機(jī)制。通過在確定流動條件下培養(yǎng)的 EC、新生視網(wǎng)膜血管生成和后肢缺血模型，miR-342 被鑒定為一種機(jī)械 miR，通過靶向 EYA3 減弱 MYC 表達(dá)來促進(jìn) EC 動脈化并改善血流灌注，從而穩(wěn)定 MYC。這些結(jié)果提供的見解將有助于優(yōu)化缺血性疾病的血管再生。

首先，使用體外層流對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）施加15 dyn/cm2剪切應(yīng)力持續(xù)12或24 h以研究miR-342是否對血流誘導(dǎo)的剪切應(yīng)力（FSS）做出反應(yīng)。與在靜態(tài)對照 HUVECs 相比，FSS 條件下miR-342 及其宿主基因 EVL 顯著上調(diào)。FSS 始終激活 Notch 信號，并上調(diào) miR-342 和 EVL，這可以被 Notch 抑制劑（DAPT）消除。這表明，剪切應(yīng)力通過激活 HUVECs 中 Notch 上調(diào) miR-342 表達(dá)。基因集富集分析（GSEA）和熱圖分析顯示，在靜態(tài)培養(yǎng)的 HUVECs 中，miR-342 過表達(dá)上調(diào)了剪切應(yīng)力相關(guān)基因特征，如 KLF2 和 KLF4。但miR-342 表達(dá)降低的 HUVECs 在FSS下無法平行排列，阻斷miR-342 在LSS下顯著下調(diào) KLF4 和 KLF2 的表達(dá)。這些結(jié)果表明，miR-342 介導(dǎo) ECs 對 FSS 的反應(yīng)。

FSS 激活 Notch 信號，從而上調(diào)動脈標(biāo)志物。與此一致的是，在 FSS 下過表達(dá) miR-342 的 HUVECs 也表現(xiàn)出動脈標(biāo)志物（包括EFNB2、GJA4、GJA5和HEY2）表達(dá)的顯著增加及靜脈標(biāo)志物（包括EPHB4、NRP2和NR2F2）表達(dá)的減少，靜態(tài)對照組則呈現(xiàn)相反的效應(yīng)。體內(nèi)熒光原位雜交（FISH）染色顯示，miR-342 陽性信號主要位于腎臟、肝臟和肺組織的動脈中。這表明，miR-342 介導(dǎo)剪切應(yīng)力對動脈基因表達(dá)增強(qiáng)的影響。

進(jìn)一步利用Matrigel栓塞試驗(yàn)檢測血管生成情況，免疫染色顯示，miR-342 顯著增加 EC 標(biāo)志物 CD31 和動脈標(biāo)志物 GJA4 或血管平滑肌細(xì)胞（vSMC）標(biāo)志物 α-SMA 的共定位，表明動脈標(biāo)志物表達(dá)和 vSMC 覆蓋率增加（圖1 A、B）。

在視網(wǎng)膜血管生成模型中，miR-342 水平也顯著增加。IB4 與 α-SMA 的免疫染色表明，伴隨著血管密度降低，miR-342 的上調(diào)顯著增加視網(wǎng)膜血管中的 α-SMA⁺ vSMC，表明 vSMC 覆蓋率增加，這是動脈化的標(biāo)志（圖1 C）。qRT-PCR顯示，在注射 miR-342 的視網(wǎng)膜中動脈標(biāo)志物表達(dá)增加，而靜脈標(biāo)志物顯著降低。相比之下，玻璃體內(nèi)注射 miR-342 拮抗劑顯著降低了 α-SMA⁺ vSMC 覆蓋率，而視網(wǎng)膜血管密度略有增加（圖1 D）。這些結(jié)果表明miR-342 在體內(nèi)促進(jìn)動脈化。

圖1    miR-342在體內(nèi)增強(qiáng)EC動脈化。

接下來，評估了 miR-342 與 FSS 在 EC 動脈化調(diào)節(jié)方面的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)阻斷 miR-342 部分消除了 FSS 誘導(dǎo)的動脈標(biāo)志物上調(diào)，這表明，miR-342 介導(dǎo) FSS 誘導(dǎo)的 ECs 中動脈標(biāo)志物的上調(diào)。觸發(fā) Notch 激活發(fā)現(xiàn)其在 mRNA 和蛋白質(zhì)水平上上調(diào)動脈標(biāo)志物并下調(diào)靜脈標(biāo)志物，但敲低 miR-342 減弱了這些影響。值得注意的是，miR-342 的敲低通過 Dll4 觸發(fā)的 Notch 激活減弱動脈化。這些結(jié)果表明，miR-342 在 FSS 觸發(fā)的 Notch 激活下介導(dǎo) EC 動脈化。

MYC 基因是一種原癌基因，它主要參與細(xì)胞分裂和增殖過程。Notch 活化通過抑制 MYC 依賴性代謝和細(xì)胞周期活動來促進(jìn) EC 動脈化。miR-342 過表達(dá)顯著抑制 MYC 調(diào)節(jié)因子和細(xì)胞周期進(jìn)程相關(guān)基因。一致地，在轉(zhuǎn)染 miR-342 模擬物的 HUVECs 中，細(xì)胞周期進(jìn)程減慢。這表明，miR-342 可能通過抑制 MYC 表達(dá)來減弱 EC 細(xì)胞周期進(jìn)程。

進(jìn)一步驗(yàn)證 MYC 在 miR-342 誘導(dǎo)的 EC 動脈化中的作用，發(fā)現(xiàn) MYC 表達(dá)在 FSS 和 Notch 激活下降低。同樣，miR-342 過表達(dá)顯著下調(diào) HUVECs 中 MYC 的 mRNA 和蛋白水平（圖2 A、B），相比之下，miR-342 敲低上調(diào)了兩者水平（圖2 A、C），而阻斷miR-342 消除了 Notch 激活對 MYC 表達(dá)的抑制。這些結(jié)果表明，miR-342 通過被 FSS 觸發(fā)的 Notch 活化介導(dǎo)對 MYC 的抑制。

此外，MYC 過表達(dá)顯著促進(jìn)了細(xì)胞周期進(jìn)程（圖2 D、E），且消除了 miR-342 過表達(dá)誘導(dǎo)的 EC 動脈化，多種動脈標(biāo)志物的 mRNA 和蛋白表達(dá)被抑制，而靜脈標(biāo)志物的表達(dá)得到恢復(fù)（圖2 F、G）。這些結(jié)果證實(shí) miR-342 通過抑制 MYC 增強(qiáng)動脈化。

圖2     MYC 過表達(dá)消除了 miR-342 誘導(dǎo)的 EC 動脈化。

生物信息學(xué)分析表明MYC不是miR-342的直接靶點(diǎn)，然而，通過蛋白磷酸酶2A（PP2A）去磷酸化Thr58和Ser62來增加MYC蛋白穩(wěn)定性的EYA3的3'-UTR含有miR-342識別位點(diǎn)。進(jìn)一步研究表明，EYA3 過表達(dá)消除了 miR-342 過表達(dá)誘導(dǎo)的 MYC 的 Thr58 磷酸化和 Ser62 去磷酸化，并增加了 HUVECs 中 MYC 蛋白水平。此外，EYA3 過表達(dá)消除了 miR-342 誘導(dǎo)的 EC 動脈化。這些結(jié)果表明，miR-342 通過直接靶向 EYA3 下調(diào) MYC 來促進(jìn) EC 動脈化。

EC 動脈化是缺血性損傷后血管灌注的重要步驟。最后，為了評估 miR-342 是否可用于改善組織缺血后的血管灌注，實(shí)驗(yàn)通過結(jié)扎小鼠建立了后肢缺血模型。結(jié)果顯示，miR-342 與其宿主基因Evl在結(jié)扎的股動脈中的表達(dá)顯著降低。FISH 染色進(jìn)一步表明，結(jié)扎側(cè) ECs 中 miR-342 的表達(dá)顯著降低（圖3 A）。然后，在多側(cè)肌肉注射 miR-342 激動劑，結(jié)果顯示，其在損傷后第 7 天和第 14 天顯著改善了血管灌注（圖3 B）。此外，在 CD31+ ECs 中，與未結(jié)扎組相比，結(jié)扎后 GJA4 表達(dá)以及 CD31+ ECs 和 α-SMA+ vSMCs 的共定位顯著下調(diào)，而 miR-342 注射顯著改善了下調(diào)的動脈化（圖3 C、D）。這些結(jié)果表明，局部 miR-342 注射可能通過增強(qiáng)缺血性疾病中的 EC 動脈化來促進(jìn)血管灌注。

圖3    在后肢缺血模型中miR-342 促進(jìn) EC 動脈化并增加血流灌注。

圖4    圖形概要

miR-342-5p通過靶向EYA3抑制MYC，介導(dǎo)剪切應(yīng)力和Notch激活對促進(jìn)EC動脈化的影響，這在缺血性疾病的治療中具有潛力。

總之，該研究結(jié)果揭示了剪切應(yīng)力和 Notch 信號介導(dǎo)的內(nèi)皮動脈化的潛在機(jī)制，即 miR-342 充當(dāng)介導(dǎo)剪切應(yīng)力-Notch 信號軸的機(jī)械 miR，通過直接靶向 EYA3 下調(diào) MYC 來促進(jìn)內(nèi)皮動脈化。因此，miR-342 可能是治療缺血性疾病的潛在靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：Zhang X, Sun J, Zhang P, Wen T, Wang R, Liang L, Yang Z, Li J, Zhang J, Che B, Feng X, Liu X, Han H, Yan X. miR-342-5p downstream to Notch enhances arterialization of endothelial cells in response to shear stress by repressing MYC. Mol Ther Nucleic Acids. 2023 Apr 4;32:343-358. doi: 10.1016/j.omtn.2023.03.022. PMID: 37128275; PMCID: PMC10148082

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