相信大家看著這個標題，心情都是沉重的，尤其是對一些難養的類器官，好不容易養起來了，結果傳完代長不起來了，這是啥情況啊？今天咱們從下面3個層面分析類器官傳代失敗原因。

影響類器官傳代因素

一、類器官傳代手法

影響類器官傳代最主要的因素是傳代手法。尤其是一些嬌貴的類器官，就像溫室的花朵，經不起任何“風雨”，比如基質膠冷化條件（溫度及時長）、離心條件（溫度、轉速、時長）、棄除上清時的類器官丟失、消化條件（溫度、時長）、吹打力度對于它們來說就是“西天取經路上的九九八十一難”。

（1）基質膠冷化溫度、時長

類器官傳代時，我們需要把5-10孔（24孔板為例）的基質膠和類器官混懸物用類器官傳代緩沖液(abs9730)吹散后收集到15mL離心管，并用類器官傳代緩沖液定容到14mL。接下來冷化基質膠，可以選擇多種方式比如，4℃預冷30min； 0℃預冷30min；-20℃預冷5min。通常情況下，多數類器官都是可以采取上述三種方式，但少數類器官對溫度或時長過于敏感。對溫度過于敏感的類器官建議采用4℃預冷30min或0℃預冷30min；對時長過于敏感的類器官建議采用-20℃預冷5min。

（2）離心溫度、轉速、時長

離心對類器官可能造成的損傷主要包括：

A、機械應力損傷：離心過程中產生的機械應力可能會對類器官細胞造成破壞。這種損傷可能包括細胞膜的破裂、細胞內部結構的損傷，以及細胞功能的喪失。

B、溫度影響：離心時的溫度對類器官的保存狀態有重要影響。如果離心溫度過高，可能會導致基質膠固化，影響類器官的分離和保存。因此，建議在4°C的低溫條件下進行離心，以避免熱損傷。

基質膠冷化后在進行離心分層時，建議選用水平角離心機，轉速控制200g-300g，溫度設為4℃，時長控制在5min以內。

（3）棄除上清時的類器官丟失

分層現象（緩沖液、基質膠、類器官沉淀）

離心后的類器官正常是分層三層：緩沖液、基質膠、類器官沉淀，正常我們是保留類器官沉淀層，上面的緩沖液和基質膠去掉。但如果我們原代培養的類器官數量就很少，分層后的類器官沉淀層也會很少，這種情況下，我們不僅要保留類器官沉淀，還要保留基質膠的下2/3，甚至基質膠全層，以減少類器官的遺失（基質膠層會殘留類器官）。點膠時保證新膠量是殘留膠的1.5倍體積以上，以保證基質膠的貼壁粘附性。

當然，有時候離心后的類器官離心后也會出現兩層：緩沖液、基質膠類器官混懸液。這種情況，建議保留基質膠類器官混懸液下2/3，甚至基質膠全層，以減少類器官的遺失（基質膠層會殘留類器官）。點膠時保證新膠量是殘留膠的1.5倍體積以上，以保證基質膠的貼壁粘附性。

（4）消化溫度、時長

上述離心后的類器官懸液在進行消化傳代時，那么要特別注意消化溫度、時長的控制。消化過度對類器官造成的損傷體現在兩個方面：

A、細胞膜損傷和細胞死亡：消化過強可能會破壞細胞膜，導致細胞內容物釋放到培養基中，引起細胞死亡。

B、細胞凋亡增加：胰酶消化時間過長，可能會增加細胞的凋亡率。因為過度的消化可能對細胞膜造成損傷，影響細胞表面受體蛋白的功能性和完整性。

雖然消化酶在37℃下活性最好，但消化效力太強對類器官不一定是好事，通常我們在室溫超凈臺內進行類器官消化就可以了，能更好地把控消化程度，及時根據鏡檢結果終止消化進程。同時，消化時長建議2-3min即可（消化時間越長，可能會增加酶對類器官造成的損傷）。

（5）吹打力度

槍頭吹打在類器官培養中產生的主要有兩種力：機械損傷和剪切力。

A、機械損傷：這主要是指槍頭刮擦、細胞間相互碰撞等導致的細胞損傷。為了減少這部分損傷，需要盡量減小吹打力度，只要保證能夠吹下吹散細胞就行。槍頭與細胞層接觸甚至研磨會導致細胞直接死亡，因此在操作時需要控制槍頭與培養板底的間距，避免直接接觸。

B、剪切力：剪切力是指物體橫截面受到外力影響，沿外力方向相對移動的現象，這個外力就叫做剪切力。 在細胞培養基里，如果有很多氣泡，細胞處在氣泡與培養基之間，當氣泡破碎時，細胞瞬間會受到強大的剪切力影響從而導致細胞碎裂。

如果選擇機械吹打傳代方式，吹打的力度和次數對類器官活性影響很大。如果用1mL槍頭吹打，操作一定要輕柔，避免液流剪切力多類器官造成割傷，也可使用無菌巴適吸管代替槍頭，對類器官傷害小。同時吹打次數控制在30次以內，可隨時鏡下觀察，一旦類器官從基質膠中解離出來，并且有較多細胞團塊，即可停止吹打。因此， 在進行類器官吹打時，需要特別注意控制力度和技巧，以減少對細胞的損傷。

二、類器官本身

傳代后的肺癌類器官一周內基本不長

（1）類器官活性強度

不同種類的類器官活性差異很大，活性比較強的類器官有子宮內膜癌類器官、腸癌類器官，培養相對容易很多，連續傳代甚至可達30多代。然而有些類器官本身活性不足，比如甲狀腺癌類器官，只能維持原代，傳代后基本不長。除此以外，一致認為難養的類器官還有肝癌類器官、前列腺癌類器官。

（2）類器官數量

如果在原代培養中類器官數量稀少，例如24孔板，每孔點50uL基質膠細胞團混懸物，長成的類器官數量低于20個，通常是類器官數量較少的情況。此時，如果傳代操作不當，出現類器官大量丟失，就會導致傳下里的細胞團密度過稀，缺少旁分泌信號調控，類器官增殖困難，出現長不大現象。因此，原代類器官數量多少也直接影響是否能順利傳代。

三、營養體系

（1）培養基

完quan培養基（添加因子）建議分裝儲存于-20℃，有效期長達1年；保存在4℃，建議2周內用完，超過1個月，因子活性會逐漸下降。

4℃儲存太久（一個月以上）會導致培養基的效能下降，而效能下降又是怎樣影響類器官傳代效果的呢？

舉個例子：消化傳代前后使用的是同一瓶培養基，原代養得可以，傳代不行了。大家在推斷原因時可能會首先排除培養基問題，因為消化傳代前后使用的是同一瓶培養基，如果是培養基的問題，原代也養不好才對，而結果是原代養得好，傳代不好了。這里其實有大家想不到的因素存在。大家都知道類器官通常傳到一定代次會出現類器官增殖變緩（比如數量減少和體積縮小），就傳不下去了。因為類器官培養的成體干細胞或腫瘤干細胞，在經歷多次傳代后，干性（自我更新和分化能力）都會逐代降低，最后就傳不下去。在類器官原代培養中，腫瘤干或成體干細胞干性很強，即便使用4℃儲存過久的培養基，依然可以增殖起來。而當不斷傳代后，腫瘤干或成體干細胞干性逐漸下降，對培養基的因子活性需求就會提高，再使用4℃儲存過久的培養基就會難把類器官擴增起來。

（2）類器官傳代消化液

消化液對類器官傳代的影響主要體現在2個方面：

A、傳代消化液是否恰當，不合適的酶會造成類器官損傷。

B、傳代消化液建議分裝保存在-20℃，有效期長達1年，保存在4℃下，建議2周內用完，超過1個月，酶活會逐漸下降。

首先，消化酶的消化力度還取決于酶的種類。我們嘗試過胰酶進行類器官消化，發現胰酶對類器官的消化損傷比較大，不適合作為類器官傳代消化酶。所以，建議大家使用專用的類器官傳代消化液(abs9520)，其采用的多種溫和消化酶對類器官消化比較溫和。其次，消化液如果長時間存放于4℃，酶活會逐漸降低，消化類器官需要時間會想要增加，而增加消化時間，把控時長不當，容易導致消化過度，使類器官活性受損。

（3）基質膠

基質膠建議分裝保存在-20℃，有效期長達1年，保存在4℃下，建議2周內用完，超過1個月，基質膠的粘附性和因子活性會逐漸下降。

基質膠的作用有兩個，其一是起支架作用，維持類器官的橢球形態，其二是含有豐富的因子種類，對類器官的生長有促進作用。當基質膠存4℃儲存時間過久，基質膠的粘附性和因子活性均會大大降低，此時的基質膠類器官穹頂結構容易脫離培養板底面而漂浮，同時也難以維持類器官增殖需求。

今天講解就到這了，大家如有實驗問題，歡迎一起交流哦！

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