Regulation of the integrin αVβ3- actin filaments axis in early osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells under cyclic tensile stress

Keywords: Integrin αVβ3; Mesenchymal stem cells; Osteogenesis; Tensile stress; Yes-associated protein (YAP).

骨搬運(yùn)技術(shù)是目前修復(fù)肢體骨缺損的主要方法之一。在骨修復(fù)的過(guò)程中，牽張應(yīng)力刺激細(xì)胞的增殖與分化，從而實(shí)現(xiàn)骨與軟組織的同步再生。目前如何修復(fù)大骨缺損的一個(gè)重要研究方向是如何在體內(nèi)促進(jìn)干細(xì)胞的成骨分化。其中，間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是具有成骨、成軟骨、成脂肪和成肌分化功能的多能細(xì)胞，在再生醫(yī)學(xué)中具有巨大的潛力。

整合素是一類(lèi)重要的細(xì)胞表面受體，由α亞基和β亞基以非共價(jià)鍵結(jié)合形成的跨膜異二聚體糖蛋白。整合素通過(guò)募集多種細(xì)胞內(nèi)蛋白并將細(xì)胞內(nèi)微絲細(xì)胞骨架與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）連接起來(lái)形成黏著斑復(fù)合物，從而將機(jī)械信號(hào)從細(xì)胞外部傳遞到細(xì)胞內(nèi)部。YAP 是一種轉(zhuǎn)錄共激活因子，可與 TEAD-DNA 結(jié)合蛋白結(jié)合以促進(jìn)細(xì)胞增殖并調(diào)節(jié)干細(xì)胞分化。然而，循環(huán)牽張應(yīng)力（CTS）影響細(xì)胞內(nèi) YAP 表達(dá)從而調(diào)節(jié) MSCs 成骨的機(jī)制仍不清楚。

鑒于整合素與機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)的密切相關(guān)，廣東省醫(yī)學(xué)3D打印與生物力學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室歐陽(yáng)鈞教授科研團(tuán)隊(duì)在一項(xiàng)研究中探討了人間充質(zhì)干細(xì)胞成骨過(guò)程中牽張應(yīng)力和整合素αVβ3對(duì)細(xì)胞分化的影響。研究表明，整合素αVβ3 在循環(huán)牽張應(yīng)力誘導(dǎo)的 MSCs成骨過(guò)程中表達(dá)增加，其活化可導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白絲結(jié)構(gòu)的重排，從而調(diào)控 YAP 核定位，且機(jī)械信號(hào)通過(guò) αVβ3-微絲軸影響 MSCs 的成骨。這表明，αVβ3 可能在干細(xì)胞水平上作為骨修復(fù)的新靶點(diǎn)。研究成果發(fā)表在 Cell Communication and Signaling 期刊題為“Regulation of the integrin αVβ3- actin filaments axis in early osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells under cyclic tensile stress”。

首先，研究調(diào)查了 MSCs 中循環(huán)牽張應(yīng)力（10%形變，0.5 Hz頻率，2 h/d，7d）與早期成骨分化之間的關(guān)系，與對(duì)照組相比，CTS負(fù)荷 7 天后 MSCs 中成骨標(biāo)志物 ALP 和 RUNX2 的蛋白質(zhì)和 mRNA 表達(dá)增加，這表明，循環(huán)牽張應(yīng)力可促進(jìn) MSCs 的早期成骨分化。

然后，通過(guò)qRT-PCR 分析整合素αVβ3 的表達(dá)水平以驗(yàn)證整合素是否參與循環(huán)牽張應(yīng)力誘導(dǎo)的 MSCs 成骨分化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在循環(huán)牽張應(yīng)力下整合素αVβ3 的表達(dá)高于對(duì)照組，表明循環(huán)牽張應(yīng)力促進(jìn)了整合素αVβ3 的表達(dá)。

因此，繼續(xù)研究整合素αVβ3 與循環(huán)牽張應(yīng)力誘導(dǎo)的 MSCs 早期成骨分化之間的關(guān)系。通過(guò)整合素αVβ3 的拮抗劑 RGDyk抑制整合素αVβ3 在 MSCs 中的功能，發(fā)現(xiàn)與 CTS 組相比，RGDyk 組的 ALP 染色較淺（圖1 a）。Western blotting 顯示，當(dāng) MSC 整合素αVβ3 受到抑制時(shí)，RGDyk 組的成骨標(biāo)志物 ALP 和 RUNX2 的表達(dá)相對(duì)于 CTS 組降低（圖1 b）。此外，當(dāng)整合素αVβ3 功能受到抑制時(shí)，ALP 和 RUNX2 的 mRNA 表達(dá)也降低（圖1 c）。以上結(jié)果表明，循環(huán)牽張應(yīng)力可以通過(guò)整合素αVβ3 的表達(dá)和活化影響 MSCs 的早期成骨分化。

圖1    CTS 通過(guò)整合素αVβ3 調(diào)節(jié) MSCs 成骨分化的早期階段。（a） CTS 下GM、CTS 和 RGDyk 組的 ALP 染色。（b）CTS 下GM 和 RGDyk 組 ALP 和 RUNX2 的蛋白表達(dá)。（c）CTS 下GM 和 RGDyk 組 ALP 和 RUNX2 的 mRNA 表達(dá)。實(shí)驗(yàn)分組：在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中未分化的 MSCs（GM 組）、循環(huán)牽張應(yīng)力施加 7 天的 MSCs（CTS 組）、在循環(huán)牽張應(yīng)力下用 RGDyk 處理的 MSCs（RGDyk 組）、在循環(huán)牽張應(yīng)力下用細(xì)胞松弛素D 處理的 MSCs（CytoD 組）和在循環(huán)牽張應(yīng)力下用維替泊芬處理的 MSCs（VP 組）。

黏著斑復(fù)合物連接整合素αVβ3 和肌動(dòng)蛋白絲，并以此來(lái)傳導(dǎo)機(jī)械信號(hào)。因此，接下來(lái)探討了黏著斑相關(guān)蛋白踝蛋白（Talin-1）、黏著斑激酶（FAK）和紐蛋白（Vinculin）在循環(huán)牽張應(yīng)力下的表達(dá)，并檢測(cè)了talin-1、FAK 和vinculin 在整合素αVβ3 激活下的表達(dá)。Western blotting 和 qRT-PCR 結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，循環(huán)牽張應(yīng)力有效提高了 MSCs 中三者的表達(dá)水平。使用RGDyk抑制整合素αVβ3功能后，RGDyk組其表達(dá)水平相對(duì)于CTS組降低。

免疫熒光顯示，未經(jīng)牽張應(yīng)力加載時(shí)細(xì)胞膜周邊可見(jiàn)零星點(diǎn)狀黏著斑復(fù)合體，而在循環(huán)牽張應(yīng)力負(fù)荷后，黏著斑復(fù)合體顯著增多。當(dāng)整合素 αVβ3 功能受到抑制時(shí)，黏著斑復(fù)合體又顯著減少。這表明，循環(huán)牽張應(yīng)力通過(guò)激活整合素 αVβ3 增加 MSCs 中黏著斑的形成。

通過(guò)western blotting和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在循環(huán)牽張應(yīng)力的作用下，β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）的表達(dá)升高（圖2 a）。為了了解機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中整合素αVβ3 和肌動(dòng)蛋白絲之間的關(guān)系，進(jìn)一步檢測(cè)了抑制整合素αVβ3 后 β-actin 表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，與 CTS 組相比，MSCs 中 RGDyk 組的 β-actin表達(dá)水平降低（圖2 a）。免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示，GM 組肌動(dòng)蛋白絲排列平直緊密，呈細(xì)長(zhǎng)絲狀，但在循環(huán)牽張應(yīng)力下形成較粗壯的應(yīng)力纖維絲，排列方向不規(guī)則且微絲結(jié)構(gòu)向細(xì)胞膜方向聚攏。當(dāng)整合素αVβ3 受到抑制時(shí)，肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維絲略微增厚，并類(lèi)似于 GM 組呈平直緊密方式排列（圖2 c）。以上結(jié)果表明，循環(huán)牽張應(yīng)力通過(guò)整合素αVβ3 調(diào)節(jié) β-actin的表達(dá)并影響肌動(dòng)蛋白絲的結(jié)構(gòu)。

此外，為了研究肌動(dòng)蛋白絲與循環(huán)牽張應(yīng)力誘導(dǎo)的 MSCs 成骨分化之間的關(guān)系，使用細(xì)胞松弛素D（cytochalasin D）來(lái)抑制肌動(dòng)蛋白絲的聚合。結(jié)果顯示，細(xì)胞松弛素D 在牽張應(yīng)力下降低 ALP 和 RUNX2 的表達(dá)（圖2 d），這表明，循環(huán)牽張應(yīng)力可以通過(guò)整合素αVβ3-肌動(dòng)蛋白絲軸促進(jìn) MSCs 的早期成骨分化。

圖2   肌動(dòng)蛋白絲通過(guò) MSC 中的整合素αVβ 的激活調(diào)節(jié) CTS 誘導(dǎo)的早期階段成骨分化。（a）第4 天和 7 天CTS 下 β-肌動(dòng)蛋白的蛋白質(zhì)和 mRNA 表達(dá)。（b）CTS 和 RGDyk 組 CTS 下 β-肌動(dòng)蛋白的蛋白和 mRNA 表達(dá)。（c）GM組、CTS組和RGDyk組在CTS作用下F-肌動(dòng)蛋白的免疫熒光觀察7天。

最后，研究探討了循環(huán)牽張應(yīng)力對(duì)細(xì)胞核 YAP 的影響機(jī)制。Western blotting 顯示，循環(huán)牽張應(yīng)力增加了核 YAP 的表達(dá)（圖3 a）。整合素αVβ3 受到抑制后，RGDyk 組核 YAP 的表達(dá)低于 CTS 組（圖3 b）。根據(jù)免疫熒光結(jié)果，GM 組染色的核內(nèi)YAP蛋白呈模糊細(xì)胞核狀輪廓。在循環(huán)牽張應(yīng)力下，細(xì)胞核 YAP 蛋白呈高亮表達(dá)，輪廓清晰。在整合素αVβ3 被抑制后，RGDyk 組的核內(nèi) YAP 染色低于 CTS 組（圖3 c）。以上結(jié)果表明，循環(huán)牽張應(yīng)力通過(guò)整合素αVβ3 影響 YAP 核定位。

當(dāng)細(xì)胞松弛素D 抑制 β-actin聚合時(shí)，細(xì)胞核 YAP 的表達(dá)在循環(huán)牽張應(yīng)力下降低（圖3 d）。此外，使用維替泊芬（Verteporfin）抑制核內(nèi)YAP蛋白功能，western blotting顯示YAP 核定位在牽張應(yīng)力下降低。這些發(fā)現(xiàn)表明，促進(jìn)肌動(dòng)蛋白絲結(jié)構(gòu)上的循環(huán)牽張應(yīng)力可以增加 YAP 核定位，從而影響 MSCs 的早期成骨分化。

圖3     整合素αVβ3 和肌動(dòng)蛋白絲在 CTS 誘導(dǎo)的早期成骨分化中調(diào)節(jié)核 YAP 的表達(dá)。（a）CTS 下核 YAP 蛋白表達(dá)。（b）CTS 和 RGDyk 組 CTS 下核 YAP 的蛋白表達(dá)。（c）GM、CTS 和 RGDyk 組 CTS 下 YAP 免疫熒光。（d）GM 和 CytoD 組 CTS 下核 YAP 的蛋白表達(dá)。（e）GM 和 VP 組 CTS 下 ALP 和 RUNX2 的蛋白表達(dá)

總之，該研究表明，循環(huán)牽張應(yīng)力通過(guò)激活整合素αVβ3 對(duì) MSCs早期成骨分化產(chǎn)生積極影響，導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白絲的重排和黏著斑復(fù)合物的形成增加。此外，在循環(huán)牽張應(yīng)力刺激下，肌動(dòng)蛋白絲的重排通過(guò)整合素αVβ3 在人MSCs 中增加了YAP 核定位。因此，整合素αVβ3 和 YAP 核定位可參與 MSCs 的早期成骨分化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果有助于對(duì)循環(huán)牽張應(yīng)力誘導(dǎo)的人 MSCs 的早期成骨分化產(chǎn)生新的理解。

參考文獻(xiàn)：Peng Y, Qu R, Yang Y, Fan T, Sun B, Khan AU, Wu S, Liu W, Zhu J, Chen J, Li X, Dai J, Ouyang J. Regulation of the integrin αVβ3- actin filaments axis in early osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells under cyclic tensile stress. Cell Commun Signal. 2023 Oct 30;21(1):308. doi: 10.1186/s12964-022-01027-7. PMID: 37904190; PMCID: PMC10614380.

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