Osteogenic Differentiation of Human Gingival Fibroblasts Inhibits Osteoclast Formation

Keywords: gingival fibroblasts; osteoblasts; osteoclastogenesis; osteoclasts; osteogenesis.

牙齦成纖維細胞（GFs）是牙齦組織中較豐富的細胞類型之一，它們通過產生細胞外基質（ECM）蛋白來調節和維持組織的完整性。它們還通過調節白細胞的細胞粘附、產生大量活性氧和誘導 T 細胞增殖來調節免疫和炎癥反應。GFs 已被證明通過分泌白細胞介素-4（ IL-4）和骨保護素（OPG）來抑制破骨細胞分化，突出了其在健康個體中的骨骼保護能力。另一方面，GFs 能夠在牙齦卟啉單胞菌等口腔病原體存在下誘導破骨細胞形成。一般來說，GFs 與周圍細胞之間的這種串擾在指導牙周組織炎癥反應的強度方面起著至關重要的作用。

此外，GFs 在分化成其他細胞類型（包括成骨細胞樣細胞）的潛力方面顯示出多功能性和可塑性。研究表明，分化成骨細胞樣細胞的 GFs 高度表達成骨細胞相關基因。通過這種方式，GFs 有助于骨穩態。

由于這兩個過程是否相互影響尚不清楚，因此，荷蘭阿姆斯特丹大學和阿姆斯特丹自由大學聯合牙科學術中心團隊研究了 GFs 的成骨分化對其破骨細胞誘導能力的影響。具體地說，該研究探索了成骨分化狀態（由礦化程度反映）如何影響 GFs 誘導破骨細胞前體分化為破骨細胞的能力。研究成果發表在 CELLS 期刊題為“Osteogenic Differentiation of Human Gingival Fibroblasts Inhibits Osteoclast Formation”。

首先，為了建立逐步礦化，將 GFs 分成四組培養3 周，在最后1周（min1）、2 周（min2）或全部3 周（min3）內使用或不使用成骨培養基，設置對照培養基組（C）。通過 ALP 活性、鈣濃度、掃描電子顯微鏡（SEM）、茜素紅染色和定量 PCR（qPCR）評估礦化情況。

在所有條件下培養 21 天后細胞數量增均有所加。在第21 天時，min3 條件下的細胞數量顯著減少（圖1 A）。在培養第 0 天和 21 天后測量 ALP 活性。與第 0 天相比，所有情況下的酶活性均顯著增加，并在GFs暴露于成骨培養基中時間最長的 min3組中達到高水平（圖1 B）。

然后，評估成骨分化的成纖維細胞的 Ca2+ 沉積能力，發現Ca2+ 濃度隨著時間的推移顯著增加，與其他條件相比，濃度在 min3 中最高（圖1 C）。茜素紅染色同樣證實了這一點（圖1 D）。

SEM 圖像顯示，隨著時間的推移，礦化過程成功實現。隨著長時間暴露于成骨培養基，礦物結節狀結構的數量和大小從 C 組累積增加到 min3組（圖1 E）。SEM 進一步揭示，初始礦物沉積（min1）通常在細胞頂部，而不是在沉積的基質上，在后期（min2 和 min3）更多地附著在基質結構上。

在第21天時測量早期成骨標志物 Runt 相關轉錄因子2（RUNX2）、基質蛋白 I 型膠原蛋白（COL1A1）和晚期成骨標志物骨連接素（Osteonectin）的基因表達水平，并沒有觀察到統計學上的顯著差異（圖1 F、G、H）。

總之，成骨結果表明，用成骨培養基培養長達 3 周會逐漸增加成骨參數，如鈣沉積測定所反映的礦物質沉積。SEM 分析進一步顯示，隨著時間的推移，結節狀結構增加。

圖1    GFs 的成骨分化。

接下來，將 GFs 與含有破骨細胞前體的外周血單核細胞（PBMCs）共培養3 周，檢測破骨細胞形成。?TRAcP + 多核細胞的數量是衡量骨吸收和破骨細胞活性的重要指標，因此，在第42 天時計算具有三個或更多細胞核的 TRAcP + 多核細胞的數量（圖2 A、B、C）。從對照組（C）到 min3 組，具有 3-5 個或超過 6 個細胞核的細胞數量顯著減少（圖2 B）。C 組和 min1 組破骨細胞形成最高，min3 組較低，其成骨培養基預培養時間最長（圖2 B）。

在第 28 天（與PBMCs 共培養1 周）和 42天（與PBMCs 培養3 周）時測量 TRAcP 活性，發現不同時間點之間和不同條件之間沒有顯著差異，TRAcP 活性水平相似（圖2 C）。

由于 TNF-α 即使在沒有誘導破骨細胞分化的 RANKL 情況下也能刺激破骨細胞形成，因此，研究人員進一步評估了 TNF-α 的釋放是否受礦化機制的影響。總體而言，TNF-α 分泌在第35天（與PBMCs 共培養2 周）顯著高于第28天（與PBMCs共培養1 周）。在這兩個時間點，長時間暴露于成骨培養基導致 TNF-α 分泌降低（圖2 D）。

在第21 天和第35 天（添加 PBMCs 后 14 天）測量破骨細胞發生相關基因的表達，第21 天僅涉及共培養開始時 GFs 單一培養中的表達，第35 天反映了 GFs 和 PBMCs 的共培養中的表達。RANKL 在 min3 組的表達顯著更高，表明長時間暴露于成骨培養基會增加 RANKL 表達，但在第35天時，兩組間未觀察到顯著差異。此外，OPG 水平也在 min3 組最高，且在這兩個時間點，OPG 水平都比 RANKL 高幾倍。

圖2    GFs的成骨分化抑制破骨細胞的形成。

破骨細胞形成的另一個重要分子是細胞間黏附分子-1（ICAM-1），它是 GFs 和 PBMCs 之間細胞間相互作用所必需的，第35 天時，min1 組的 ICAM-1 表達水平顯著高于min3 組；巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）蛋白表達對破骨細胞前體的增殖至關重要，其同樣在 min1 組中最高；基質金屬蛋白酶（MMPs）通過控制細胞-基質相互作用和溶解骨基質對破骨細胞遷移很重要，然而，MMP-2 表達水平在任何時間點上都沒有顯著差異；轉化生長因子β（TGF-β）可替代 RANKL，阻斷其信號通路會抑制破骨細胞形成，在第21天時，TGF-β 表達水平在 min3 組最高；樹突狀細胞特異性跨膜蛋白（DC-STAMP）被認為是細胞間融合的重要基因，在第35天時，其在C組和min2組的表達存在顯著差異；TRAcP 是破骨細胞活性的標志物，其在第35天時在整個條件下水平相似。

t-PA、u-PA 及其受體 u-PAR 等纖維蛋白溶解因子在骨代謝過程的調節中發揮作用。這些因子參與破骨細胞前體向破骨細胞的分化，調節成骨細胞對破骨細胞分化的誘導能力，并導致成骨細胞礦化細胞外基質。這些因素的變化會影響成骨細胞和破骨細胞的功能。為此，實驗最后還研究了 t-PA、u-PA 及其受體 u-PAR 的基因表達水平，發現第21天時，t-PA、u-PA 及其受體 u-PAR 表達均在 min3 組最高。

圖3    圖形概要   GFs能夠獲得成骨表型，這導致破骨細胞形成減少。

這項研究描述了人類 GFs 的成骨分化對破骨細胞形成誘導能力的影響。研究首先表明 GFs 能夠在成骨刺激下獲得成骨表型。其次，在成骨培養基中培養時間越長，GFs 破骨細胞誘導能力就越弱。GFs 已被證明可以分化成成骨細胞樣細胞，以結節形式發生鈣沉積。它們的分化程度降低了它們誘導破骨細胞的能力。這進一步表明，通過適當的刺激，GFs 有可能用于再生牙周治療。因此，未來的研究可能有助于確定調節分化過程及其對破骨細胞形成影響的確切機制和途徑。

參考文獻：Ceylan M, Schoenmaker T, Hogervorst JMA, Jansen IDC, Schimmel IM, Prins CM, Laine ML, de Vries TJ. Osteogenic Differentiation of Human Gingival Fibroblasts Inhibits Osteoclast Formation. Cells. 2024 Jun 24;13(13):1090. doi: 10.3390/cells13131090. PMID: 38994943; PMCID: PMC11240541.

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