摘要：本研究旨在探討結(jié)核DNA疫苗通過(guò)肌肉注射聯(lián)合電轉(zhuǎn)染方法在增強(qiáng)免疫反應(yīng)中的效果。我們構(gòu)建了結(jié)核DNA疫苗質(zhì)粒，并通過(guò)威尼德電轉(zhuǎn)染設(shè)備對(duì)小鼠進(jìn)行免疫接種。結(jié)果顯示，該方法顯著提高了抗體滴度和T細(xì)胞反應(yīng)。本研究為結(jié)核DNA疫苗的高效遞送提供了新的策略，具有廣闊的應(yīng)用前景。

引言

結(jié)核病（TB）是一種由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）引起的慢性傳染病，是全球公共衛(wèi)生的重要威脅。盡管現(xiàn)有疫苗卡介苗（BCG）在一定程度上能預(yù)防兒童重癥結(jié)核病，但其對(duì)成人肺結(jié)核的保護(hù)作用有限。因此，開(kāi)發(fā)新型結(jié)核病疫苗顯得尤為重要。DNA疫苗作為一種新型疫苗，具有安全性高、制備簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)備受關(guān)注。然而，DNA疫苗的免疫效果往往受限于其較低的轉(zhuǎn)染效率和抗原表達(dá)水平。為了提高DNA疫苗的免疫效果，多種遞送方法被探索，其中電轉(zhuǎn)染法因其高效、安全的特性而備受矚目。本研究通過(guò)肌肉注射聯(lián)合電轉(zhuǎn)染的方法，探討結(jié)核DNA疫苗在小鼠體內(nèi)的免疫效果，旨在為結(jié)核DNA疫苗的高效遞送提供新的策略。

材料與方法

1. 結(jié)核DNA疫苗質(zhì)粒的構(gòu)建

本研究使用的結(jié)核DNA疫苗質(zhì)粒編碼結(jié)核分枝桿菌的主要抗原Ag85A。質(zhì)粒的構(gòu)建采用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)。具體步驟如下：

1. 目的基因的獲取：從結(jié)核分枝桿菌H37Rv株基因組中擴(kuò)增Ag85A基因，引物設(shè)計(jì)依據(jù)GenBank公布的序列，確保擴(kuò)增產(chǎn)物包含完整的編碼區(qū)。

2. 質(zhì)粒載體的選擇：選用真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+），該載體含有CMV啟動(dòng)子，能有效驅(qū)動(dòng)目的基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。

3. 質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定：將擴(kuò)增的Ag85A基因片段插入pcDNA3.1（+）載體，通過(guò)酶切和測(cè)序驗(yàn)證質(zhì)粒的正確性。

2. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

選取6-8周齡的雌性BALB/c小鼠，隨機(jī)分為三組，每組10只：

• 對(duì)照組：肌肉注射生理鹽水。

• DNA疫苗組：肌肉注射結(jié)核DNA疫苗質(zhì)粒。

• DNA疫苗+電轉(zhuǎn)染組：肌肉注射結(jié)核DNA疫苗質(zhì)粒后，立即使用威尼德電轉(zhuǎn)染設(shè)備進(jìn)行肌肉電轉(zhuǎn)染。

3. 電轉(zhuǎn)染方法

采用威尼德電轉(zhuǎn)染設(shè)備，具體步驟如下：

1. 注射DNA疫苗：小鼠后腿肌肉注射100 μg結(jié)核DNA疫苗質(zhì)粒。

2. 電轉(zhuǎn)染參數(shù)設(shè)置：根據(jù)威尼德設(shè)備說(shuō)明書(shū)，設(shè)置電壓、脈沖寬度和脈沖次數(shù)等參數(shù)。

3. 電極針插入：在注射部位插入電極針，確保電極針與肌肉組織充分接觸。

4. 電脈沖處理：?jiǎn)?dòng)電轉(zhuǎn)染設(shè)備，進(jìn)行電脈沖處理。

4. 免疫方案

小鼠在第0天和第21天分別進(jìn)行免疫接種，共兩次。

5. 抗體檢測(cè)

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)小鼠血清中特異性抗體滴度。步驟如下：

1. 包被抗原：用Ag85A蛋白包被96孔板。

2. 封閉：用5%脫脂奶粉封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。

3. 加樣：加入小鼠血清樣品，孵育。

4. 二抗孵育：加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體。

5. 顯色：加入TMB底物顯色，測(cè)定OD450值。

6. T細(xì)胞反應(yīng)檢測(cè)

采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（ELISPOT）檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞中特異性T細(xì)胞反應(yīng)。步驟如下：

1. 脾細(xì)胞分離：無(wú)菌條件下分離小鼠脾細(xì)胞。

2. 細(xì)胞培養(yǎng)：將脾細(xì)胞與Ag85A蛋白共培養(yǎng)。

3. 捕獲抗體包被：用IFN-γ捕獲抗體包被ELISPOT板。

4. 細(xì)胞孵育：將培養(yǎng)的脾細(xì)胞加入ELISPOT板。

5. 檢測(cè)抗體孵育：加入生物素標(biāo)記的抗IFN-γ檢測(cè)抗體。

6. 顯色：加入AEC底物顯色，計(jì)數(shù)斑點(diǎn)數(shù)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 抗體滴度檢測(cè)結(jié)果

ELISA結(jié)果顯示，DNA疫苗+電轉(zhuǎn)染組小鼠血清中特異性抗體滴度顯著高于DNA疫苗組（P<0.01），而DNA疫苗組抗體滴度又顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。這表明電轉(zhuǎn)染顯著增強(qiáng)了結(jié)核DNA疫苗的抗體反應(yīng)。

2. T細(xì)胞反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果

ELISPOT結(jié)果顯示，DNA疫苗+電轉(zhuǎn)染組小鼠脾細(xì)胞中特異性IFN-γ分泌細(xì)胞數(shù)顯著高于DNA疫苗組（P<0.01），而DNA疫苗組又顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。這表明電轉(zhuǎn)染顯著提高了結(jié)核DNA疫苗的T細(xì)胞反應(yīng)。

討論

本研究通過(guò)肌肉注射聯(lián)合電轉(zhuǎn)染的方法，探討了結(jié)核DNA疫苗在小鼠體內(nèi)的免疫效果。結(jié)果表明，該方法顯著提高了抗體滴度和T細(xì)胞反應(yīng)，為結(jié)核DNA疫苗的高效遞送提供了新的策略。

1. 電轉(zhuǎn)染增強(qiáng)DNA疫苗免疫效果的作用機(jī)制

電轉(zhuǎn)染是一種物理方法，通過(guò)短暫的高壓電場(chǎng)作用，使細(xì)胞膜產(chǎn)生微小孔隙，從而允許DNA分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。這種方法具有高效、安全、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。在本研究中，電轉(zhuǎn)染顯著提高了結(jié)核DNA疫苗的轉(zhuǎn)染效率，進(jìn)而增強(qiáng)了抗原表達(dá)水平，從而誘導(dǎo)了更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。

2. 結(jié)核DNA疫苗肌肉注射與電轉(zhuǎn)染的聯(lián)合應(yīng)用優(yōu)勢(shì)

肌肉注射是一種常用的疫苗接種方法，具有操作簡(jiǎn)便、疼痛小等優(yōu)點(diǎn)。然而，肌肉注射DNA疫苗往往面臨轉(zhuǎn)染效率低、抗原表達(dá)水平不足等問(wèn)題。電轉(zhuǎn)染的引入，有效解決了這些問(wèn)題，顯著提高了DNA疫苗的免疫效果。此外，肌肉注射與電轉(zhuǎn)染的聯(lián)合應(yīng)用還具有操作簡(jiǎn)便、易于推廣等優(yōu)點(diǎn)，為結(jié)核DNA疫苗的臨床應(yīng)用提供了可能。

3. 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)與應(yīng)用前景

本研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于將肌肉注射與電轉(zhuǎn)染聯(lián)合應(yīng)用于結(jié)核DNA疫苗的免疫研究中，并取得了顯著效果。該方法不僅提高了DNA疫苗的免疫效果，還為結(jié)核DNA疫苗的高效遞送提供了新的策略。在應(yīng)用前景方面，該方法具有廣闊的市場(chǎng)空間，有望為結(jié)核病的預(yù)防和治療提供新的手段。此外，該方法還可應(yīng)用于其他DNA疫苗的研發(fā)和遞送中，具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。

結(jié)論

本研究通過(guò)肌肉注射聯(lián)合電轉(zhuǎn)染的方法，探討了結(jié)核DNA疫苗在小鼠體內(nèi)的免疫效果。結(jié)果表明，該方法顯著提高了抗體滴度和T細(xì)胞反應(yīng)，為結(jié)核DNA疫苗的高效遞送提供了新的策略。本研究不僅為結(jié)核病的預(yù)防和治療提供了新的手段，還為其他DNA疫苗的研發(fā)和遞送提供了有益參考。未來(lái)，我們將進(jìn)一步優(yōu)化該方法，探索其在結(jié)核病疫苗臨床應(yīng)用中的潛力。