酶聯免疫吸附測定（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay，ELISA）是免疫學和分子生物學中廣泛使用的實驗室技術。免疫分析是一種利用特定抗體與抗原或半抗原發生的高選擇性高特異性識別和結合原理，對待測抗體或者抗原進行分析測定的方法，酶聯免疫吸附分析（下稱ELISA）是免疫分析的一種，分三個部分組成：免疫識別，信號輸出和數據處理。

       ELISA實驗測定操作簡單，一般涉及到樣本的收集保存、試劑準備、加樣、溫育、洗板、顯色、結果判斷和結果報告及解釋等方面，其中任一步驟的不當都會影響測定結果，且尤以加樣、溫育和洗板等步驟為甚。

一、ELISA實驗加樣過程：

ELISA實驗中一般需要 4 次加樣，即加樣本、加檢測抗體、加底物和加終止液。

                                             ELISA加樣

● 實驗室使用的微量加樣器應注意保養并定期校正。ELISA比較敏感，每孔加入液體量誤差會導致最后讀數差別，因此避免儀器帶來誤差。

●  加樣前，溶液充分混勻，加樣時不可90度向孔中滴加液體，否則會導致液體殘留在吸頭上，加樣不準確。正確加樣方法應為45度，吸頭貼著孔壁和液面的交界處加入。

●  加樣品時，單孔用量要求：≥50ul/指標，如需要做復孔則所需樣本量≥100ul/指標。如果樣本量不充足，具體用量可咨詢您的專屬銷售。

●  加樣時速度不可過快，否則無法保證微量加樣的準確性和均一性。

●  加樣時避免液體濺出，如有樣本濺出，應用吸水紙輕輕拭干，并做相應記錄。

●  每次加樣順序一致，尤其底物、終止液順序一致，保證每個孔顯色時間相同。

●  加完顯色液后，放入一個可推拉的抽屜內，就可以避光振蕩了。

二、ELISA實驗加樣技巧：

●  用一張寫滿字的紙，字越多越好，比如報紙，墊在下面，這樣，加過標本的小孔看過去下面的字會變小，沒加的字正常，非常容易區分。

●  可以利用液面反光與沒有加的孔加以區別。

三、ELISA實驗加樣問題解答：

以下問題可能因多種原因引起，本文僅討論加樣的解決方法：

Q： 同一個樣本間的各個復孔的讀數有顯著性差異？

A： 加樣量多少不一，操作時間長短不一。重復同一樣本時，加樣量與加樣時間理應相同，同時也應注意移液器的校準。加樣后可輕微晃動酶標板使反應液充分混合。

Q： 陽性對照讀數不正常？

A： 加樣量不正確。應保持每次加樣的步驟不要有太大的差異，有條件的應該考慮使用排槍。

Q： 血清本底高？

A： 加樣時使用同一槍頭、交叉污染。每次吸樣注意更換吸頭，做到一樣一吸頭，避免交叉污染。

Q： 實驗的標準曲線和測定的重復性差？

A： 1. 可能原因：加樣本及試劑量不準；孔間不一致；校正移液器，吸嘴要配套，裝吸嘴時要緊密；重復某一樣品時，加樣時間盡可能與第一次接近；重復測定標本，操作條件、人員等應盡可能與上次保持一致，以排除這些因素造成的不一致的可能性；樣品稀釋前應充分混勻。

2. 可能原因：加樣過快，孔間發生污染；重復測定標本，操作條件、人員等應盡可能與上次保持一致，以排除這些因素造成的不一致的可能性；加樣不要過快。

3. 可能原因：加錯樣本；檢查記錄和試劑，是否加錯樣本。

4. 可能原因：加樣本及試劑時，加在孔壁上部非包被區；加樣槍頭不要貼壁。