WB，蛋白質印跡(Western blotting)又稱免疫印跡(immunoblotting)，是根據抗原抗體的特異性結合檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術基礎上發展起來的一種新的免疫生化技術，具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現已成為蛋白分析的一種常規技術。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白，并能對蛋白進行定性和半定量分析。

WB實驗操作步驟：

1、收集蛋白樣品

蛋白提取的質量直接決定著 WB 結果的好壞，因此，根據標本類型和檢測類型選擇合適的蛋白制備方法是至關重要的。

使用Western及IP細胞裂解液裂解貼壁細胞、懸浮細胞或組織樣品，為了防止蛋白的降解，或保證磷酸化或乙酰化蛋白的穩定，需要額外添加蛋白酶抑制劑 / 蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑等蛋白抑制劑、或者乙酰化酶抑制劑混合物。

對于某些特定的亞細胞組份蛋白，例如細胞核蛋白的細胞核蛋白提取試劑盒 、細胞漿蛋白細胞膜蛋白與細胞漿蛋白提取試劑盒、線粒體蛋白等，可以參考相關文獻提取這些亞細胞組分蛋白，也可使用商業化的試劑盒進行提取。

收集完蛋白樣品后，為確保每個蛋白樣品的上樣量一致，需要測定每個蛋白樣品的蛋白濃度。根據所使用的裂解液的不同，需要采用適當的蛋白濃度測定方法。目前常用BAC試劑盒測定樣品蛋白的含量。

2、電泳

（1）蛋白樣品的變性

取相同質量的細胞裂解液（體積×蛋白質濃度），并加等體積的sds-page蛋白上樣緩沖液，若樣品是非變性的，可加入非變性的上樣緩沖液。電泳樣品加入樣品處理液后，要經過高溫處理，其目的是將SDS與蛋白質充分結合，以使蛋白質*變性和解聚，并形成棒狀結構。樣品處理液中通常還加入溴酚藍染料，溴酚藍指示劑是一個較小的分子，可以自由通過凝膠孔徑，所以它顯示著電泳的前沿位置，當指示劑到達凝膠底部時，即可停止電泳。另外樣品處理液中也可加入適量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加樣時樣品溶液可以沉入樣品凹槽底部。至此，電泳樣品已準備就緒，可立即使用也可以分裝凍存，-20℃存放的樣品可穩定保持數月。

（2）電泳凝膠制備

電泳凝膠的制備可以直接使用sds-page試劑盒進行操作。

（3）上樣和電泳

冰上冷卻后，把將處理好的蛋白樣品按照預定的順序上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內中。注意的是加樣孔有多時，可加入等體積的上樣緩沖液，最后記得點上預染蛋白質分子量Marker。預染Marker便于在電泳過程中監測蛋白質分離，也可以在隨后的轉膜步驟中指示轉移效率。Marker也用樣品緩沖液調整至與樣品等體積。

加足夠的電泳緩沖液后開始準備上樣。（電泳液至少要漫過內測的小玻璃板。）用微量進樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個樣品時，進樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次，以免交叉污染。

3、轉膜

（1）、*常用于Western Blot的轉移膜主要是聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene Fluoride, PVDF膜。

（2）、在加電泳轉移緩沖液的搪瓷盤里放入轉膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過的膜。

（3）、將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回搟幾遍以搟走里面的氣泡。（一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動。）在墊子上墊三層濾紙（可三張紙先疊在一起在墊于墊子上），一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。

（4）、要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時候動作要輕，要在兩個邊上輕輕的反復撬。撬一會兒玻璃板便開始松動，直到撬去玻板。（撬時一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作），要避免把分離膠刮破。小心剝下分離膠蓋于濾紙上，用手調整使其與濾紙對齊，輕輕除去氣泡。將膜蓋于膠上，要蓋滿整個膠（膜蓋下后不可再移動）并除氣泡。在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個海綿墊，搟幾下就可合起夾子。整個操作在轉移液中進行，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會發生短路。（轉移液含甲醇，操作時要戴手套，實驗室要開門以使空氣流通。）

4、封閉

雜交膜上有很多非特異性的蛋白質結合位點，為防止這些位點與抗體結合引起非特異的染色和背景，一般用惰性蛋白質或非離子去污劑封閉膜上的未結合位點來降低抗體的非特異性結合。封閉劑應該封閉所有未結合位點而不替換膜上的靶蛋白、不結合靶蛋白的表位，也不與抗體或檢測試劑有交叉反應。常用的封閉試劑有 5%的BSA或者脫脂奶粉，緩沖液一般選擇 PBST或者TBST，或者封閉液。

一般封閉條件為：室溫或者 37℃緩慢搖蕩1～2h，特殊情況也可 4℃過夜。根據結果情況調整封閉試劑的濃度和類型。比如有時 BSA 比脫脂奶粉更有利于降低非特異性背景，而有些抗體則在脫脂奶粉封閉的情況下才能得到清晰的背景。

封閉完成后要進行洗膜，以去除膜上未結合的封閉試劑。

5、一抗和二抗孵育
一抗孵育

按照適當比例用TBST或者一抗稀釋液稀釋一抗。

吸盡封閉液后，立即加入稀釋好的一抗，室溫或4℃在搖床上緩慢搖動孵育1～2小時。如果一抗孵育一小時效果不佳，可以在4℃緩慢搖動孵育過夜。

回收一抗。然后加入Western洗滌液或者TBST，在搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌5-10分鐘。共洗滌6次。如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數。

二抗孵育      

按照適當比例用TBST或者二抗稀釋液稀釋二抗

吸盡洗滌液后，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4℃在搖床上緩慢搖動孵育1～2小時。

然后加入Western洗滌液或者TBST，在搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數。

前2步洗滌是為了洗去一抗和二抗的非特異性結合，洗滌的效果直接影響結果背景的深淺，所以洗滌一定要干凈。洗滌液使用 TBST 或者 PBST，其中的 Tween20 有助于去除非特異性的結合，減少背景。同時短時間多次的洗膜（如 5-6次，每次 3分鐘）比 長時間少次數的洗膜更有效。

Western結果通常需要提供內參作為對照，通常可以選用Tubulin抗體、Actin抗體或GAPDH抗體，進行內參檢測。

6、顯色反應

底物發光法：將兩種顯色底物1：1等體積混合后將其覆蓋在膜表面使其均勻，用玻璃膠片把膜包起來，馬上在暗室中將X光片覆蓋在膜的上面（時間根據光的亮度來衡量），顯影、定影。（熒光在一段時間后會越來越弱，要控制好時間）

7、蛋白膜的重復利用

如果蛋白樣品非常寶貴，可以使用Western一抗二抗去除液或者TBST處理蛋白膜，以重復利用蛋白膜。